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| | PRO-level points: 48, Questions answered: 25 | | Check, Money order | Sample translations submitted: 3 French to Italian: OUCHES DE MICROORGANISMES OPTIMISEES POUR DES VOIES DE BIOSYNTHESE CONSOMMATRICES DE NADPH
General field: Law/Patents
Detailed field: Biology (-tech,-chem,micro-) | Source text - French
[0001] Le NADP (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate) participe sous sa forme réduite, NADPH, aux réactions intracellulaires d'oxydoréductions impliquant des enzymes à activité déshydrogénase ou réductase.
[0002] La présente invention concerne des souches de microorganismes optimisées pour la production par biotransformation, de molécules ayant des voies de biosynthèse consommatrices de NADPH. Les souches selon l'invention sont utilisables dans des procédés de biotransformation consommateurs de NADPH. Les souches définies selon l'invention peuvent être procaryotiques ou eucaryotiques. Dans un mode de réalisation préféré, ladite souche procaryotique est une souche d'Escherichia coli. Dans un autre mode de réalisation, ladite souche eucaryotique est une souche de Saccharomyces, en particulier S. cerevisiae.
[0003] La présente invention concerne également un procédé de préparation de molécules par biotransformation comprenant la culture dans un milieu approprié d'une souche optimisée selon l'invention, ladite souche optimisée comprenant également les éléments génétiques nécessaires à la préparation de ladite molécule.
[0004] Les procédés de biotransformation ont été développés pour permettre la production de molécules en grande quantité à des coûts faibles, tout en permettant également la valorisation de différents sous-produits industriels ou de l'agriculture.
[0005] Pour produire des molécules d'intérêt par biotransformation in vivo on distinguera deux grandes approches :
d'une part la fermentation qui permet la production de molécules par un microorganisme à partir d'une source de carbone simple (e.g. WO0102547 qui décrit la production de lysine par fermentation de C. glutamicum en présence de glucose),
d'autre part la bioconversion par un microorganisme d'un co-substrat donné en une molécule d'intérêt (e.g. WO0012745 qui décrit la production de dérivés R-pipéridine, WO0068397 qui décrit la production de tagatose). Le co-substrat est non assimilable ; il est différent de la source de carbone qui est utilisée seulement pour produire la biomasse et le NADPH nécessaire à la bioconversion.
[0006] L'amélioration d'un procédé de biotransformation peut porter sur différents facteurs comme la température, l'oxygénation, la composition du milieu, le procédé de récupération, etc. On peut aussi envisager de modifier le microorganisme de telle sorte que la production de la molécule d'intérêt et/ou son excrétion soit augmentée.
[0007] Dans le cadre d'une fermentation on s'attachera par exemple à optimiser la voie de biosynthèse, par exemple en modifiant la régulation des gènes ou en modifiant les gènes afin de modifier les caractéristiques des enzymes impliquées, ou encore en optimisant la régénération des cofacteurs.
[0008] Dans le cadre de la bioconversion on s'attachera davantage à réduire la formation de co-produits et à optimiser la régénération de cofacteurs impliqués dans la ou les étapes de bioconversion.
[0009] Parmi les cofacteurs impliqués dans les biotransformations, le NADPH prend une part importante notamment pour la production des acides aminés (e.g. arginine, proline, isoleucine, méthionine, lysine), de vitamines (e.g. panthoténate, phylloquinone, tocophérol), de molécules aromatiques (e.g. WO401564), de polyols (e.g. xylitol), de polyamines (e.g. spermidine). d'hydroxyesters (e.g. éthyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate) ou d'autres molécules à haute valeur ajoutée.
[0010] La présente invention concerne donc une souche de microorganismes optimisée pour la production de molécules ayant des voies de biosynthèse consommatrices de NADPH telle que définie dans la revendication 1.
[0011] Au lieu d'essayer d'optimiser pour chaque biotransformation le ratio NADPH/NADP dans le microorganisme, les inventeurs ont opté pour la production de microorganismes modifiés afin d'obtenir différents ratios NADPH/NADP , lesdits microorganismes modifiés étant ensuite employés pour réaliser les biotransformations consommatrices de NADPH.
[0012] Par souche de microorganismes, on entend selon l'invention un ensemble de microorganismes d'une même espèce comprenant au moins un microorganisme de ladite espèce. Ainsi, les caractéristiques décrites pour la souche s'appliquent à chacun des microorganismes de ladite souche. De même, les caractéristiques décrites pour l'un des microorganismes de la souche s'appliqueront à l'ensemble desdits microorganismes la composant.
[0013] Parmi les microorganismes optimisés selon l'invention, on citera les bactéries et les levures, les champignons filamenteux et notamment les bactéries et les levures des espèces suivantes : Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacter sp., Penicillium sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp., Candida sp.
[0014] Le principe de l'optimisation du ratio NADPH/NADP est décrit ci-après pour E. coli et S. cerevisiae. Le même principe peut être appliqué de manière similaire à tous les microorganismes cultivés en conditions aérobies.
[0015] Le principe de l'optimisation du ratio NADPH/NADP consiste à limiter les activités enzymatiques impliquées dans l'oxydation du NADPH, et à favoriser les activités enzymatiques permettant la réduction du NADP . On limite les activités enzymatiques impliquées dans l'oxydation du NADPH en diminuant, et plus particulièrement en inactivant, de telles activités, notamment les activités de type quinone oxidoréductase et/ou transhydrogénase soluble. On favorise les activités enzymatiques permettant la réduction du NADP en imposant le flux de carbone via le cycle des pentoses phosphate et/ou en modifiant la spécificité de cofacteur d'au moins une enzyme de telle sorte qu'elle utilise le NADP préférentiellement au NAD, son cofacteur habituel.
[0016] Les souches optimisées selon l'invention sont obtenues par biologie moléculaire. L'homme du métier connaît les protocoles permettant de modifier le caractère génétique des microorganismes. Les techniques de transformation sont documentées et sont à la portée de l'homme du métier (Sambrook et al., 1989 Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
[0017] Les procédés permettant de limiter une activité enzymatique consistent à modifier le gène permettant son expression par un moyen approprié, par exemple en apportant une ou plusieurs mutation(s) dans la partie codante du gène concerné, ou en modifiant la région promotrice, notamment en la remplaçant par une séquence permettant de diminuer l'expression du gène.
[0018] Les procédés permettant d'inactiver une activité enzymatique consistent à inactiver le produit d'expression du gène concerné par un moyen approprié, ou bien à inhiber l'expression du gène concerné, ou encore à déléter au moins une partie du gène concerné, de manière à ce que soit son expression n'ait pas lieu (par exemple délétion d'une partie ou de l'ensemble de la région promotrice nécessaire à son expression), soit le produit d'expression ait perdu sa fonction (par exemple délétion dans la partie codante du gène concerné).
[0019] De manière préférentielle, la délétion d'un gène comprend la suppression de l'essentiel dudit gène, et le cas échéant son remplacement par un gène marqueur de sélection permettant de faciliter l'identification, l'isolement et la purification des souches optimisées selon l'invention.
[0020] L'inactivation d'un gène chez E. coli se fait préférentiellement par recombinaison homologue (Datsenko, K.A. ; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645). Le principe d'un protocole en est rappelé brièvement : on introduit dans la cellule un fragment linéaire, obtenu in vitro, comprenant les deux régions flanquant le gène, et au moins un gène de sélection entre ces deux régions (généralement un gène de résistance à un antibiotique), ledit fragment linéaire présentant donc un gène inactivé. On sélectionne les cellules ayant subi un événement de recombinaison et ayant intégré le fragment introduit par étalement sur milieu sélectif. On sélectionne ensuite les cellules ayant subi un événement de double recombinaison, dans lesquelles le gène natif a été remplacé par le gène inactivé. Ce protocole peut être amélioré en utilisant des systèmes de sélections positive et négative, afin d'accélérer la détection des événements de double recombinaisons.
[0021] L'inactivation d'un gène chez S.cerevisiae se fait également préférentiellement par recombinaison homologue (Baudin et al., Nucl. Acids Res. 21, 3329-3330, 1993; Wach et al., Yeast 10, 1793-1808, 1994; Brachmann et al., Yeast. 14 :115-32, 1998).
[0022] Les procédés permettant de favoriser une activité enzymatique consistent à stabiliser le produit d'expression du gène concerné par un moyen approprié par exemple en diminuant sa sensibilité à des effecteurs allostériques, ou bien à augmenter l'expression du dit gène de manière à augmenter la quantité d'enzyme.
[0023] La surexpression d'un gène peut être effectuée par changement du promoteur de ce gène in situ, par un promoteur fort ou inductible. De façon alternative, on introduit, dans la cellule, un plasmide réplicatif (simple ou multicopies) dans lequel le gène que l'on désire surexprimer est sous le contrôle du promoteur adéquat. Dans le cas de modification d'Escherichia coli, on pourra par exemple utiliser les promoteurs Plac-o, Ptrc-o, ptac-o, trois promoteurs forts bactériens pour lesquels l'opérateur lac (lacO) a été délété pour les rendre constitutifs. Dans le cas de modifications de Saccharomyces cerevisiae, on pourra par exemple utiliser les promoteurs Ppgk, Padh1, Pgal1, Pgal10.
[0024] Les procédés permettant de modifier la spécificité de cofacteur d'une enzyme de telle sorte qu'elle utilise le NADP préférentiellement au NAD, consistent à modifier la séquence du gène permettant l'expression de cette enzyme (Bocanegra, J.A. Scrutton, N.S. ; Perham, R.N. (1993) Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering. Biochemistry 32 : 2737-2740).
[0025] Les souches optimisées selon l'invention (i.e. capacité accrue de réduction du NADP ) comprennent l'atténuation voire l'inactivation, d'une ou plusieurs activité(s) enzymatique(s) oxydant le NADPH, et en particulier, des activités de type quinone oxidoréductase et/ou transhydrogénase soluble.
[0026] On citera pour exemples d'enzymes oxydant le NADPH et sans que cette liste soit limitative les activités et les gènes suivants :
Activités enzymatiques Numéro EC Gènes E. coli Gènes S. cerevisiae
Alcool déshydrogénase 1.1.1.2 yahK ADH6
Aldose réductase 1.1.1.21 GRE3
Shikimate déshydrogénase 1.1.1.25 aroE ARO1
Méthylglyoxal réductase 1.1.1.78 GRE2p
Gamma-glutamyl phosphate réductase 1.2.1.41 proA PRO2
2,4-diénoyl coenzyme A réductase 1.3.1.34 fadH
Glutamate déshydrogénase 1.4.1.4 gdhA GDH1, GDH2
Glutamate synthase 1.4.1.13 gltB, gltD GLT1
Méthylènetétrahydrofolate déshydrogénase 1.5.1.5 fold ADE3, MIS1
Transhydrogénase soluble 1.6.1.1 udhA
Transhydrogénase membranaire 1.6.1.2 pntA, pntB
Quinone oxidoréductase 1.6.5.5 qor ZTA1
Nitrite réductase 1.7.1.4 nirB, nirD
Sulfite réductase 1.8.1.2 cysl, cysJ
Stérol déméthylase 1.14.13.70 ERG11
4-Hydroxy-3-méthylbut-2-ényl diphosphate réductase 1.17.1.2 ispH
Flavodoxin réductase 1.18.1.2 fpr
[0027] Les souches optimisées selon l'invention (i.e. capacité accrue de réduction du NADP comprennent également des modifications permettant de favoriser une ou plusieurs activité(s) enzymatique(s) réduisant le NADP , et en particulier, des modifications permettant d'imposer le flux de carbone via le cycle des pentoses phosphate, et/ou des modifications portant sur la spécificité de cofacteur d'au moins une enzyme, de telle sorte qu'elle utilise le NADP préférentiellement au NAD, son cofacteur habituel.
[0028] Les activités susceptibles d'être modifiés dans les souches optimisées selon l'invention (i.e. capacité accrue de réduction du NADP ) afin de favoriser une ou plusieurs activité(s) enzymatique(s) réduisant le NADP , sont décrites ci-dessous :
Activités enzymatiques Numéro EC Gènes E. coli Gènes S. cerevisiae
Phosphoglucose isomérase 5.3.1.9 pgi PGI1
Phosphofructokinase 2.7.1.11 pfkA, pfkB PFK1, PFK2
Glucose 6-phosphate déshydrogénase 1.1.1.49 zwf ZWF1
6-Phosphogluconolactonase 3.1.1.31 SOL1, SOL2, SOL3, SOL4
6-Phosphogluconate déshydrogénase 1.1.1.44 gnd GND1, GND2
6-Phosphogluconate déshydratase 4.2.1.12 edd
Malate synthase 2.3.3.9 aceB DAL7
Isocitrate lyase 4.1.3.1 aceA ICL1
Isocitrate déshydrogénase 1.1.1.42 icd IDP1, IDP2, IDP3
Isocitrate déshydrogénase kinase/phosphatase 2.7.1.116 aceK
Dihydrolipoamide déshydrogénase 1.8.1.4 Ipd LPD1
Glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase 1.2.1.12 gapA, gapC TDH1, TDH2, TDH3
[0029] Les activités enzymatiques susceptibles d'être modifiés dans les souches optimisées selon l'invention sont définies principalement par l'emploi de la dénomination de la protéine ou du gène chez E. coli ou S. cerevisiae. Cependant, cet emploi a une signification plus générale selon l'invention et englobe les activités enzymatiques correspondantes chez d'autres microorganismes. En effet en utilisant les les séquences des protéines et des gènes d'E. coli ou de S. cerevisiae, l'homme du métier est capable de déterminer les protéines et les gènes équivalents dans d'autres microorganismes qu'E. coli ou S. cerevisiae.
[0030] Les moyens d'identification des séquences homologues et de leurs pourcentages d'homologie sont bien connus de l'homme du métier, comprenant notamment le programme BLAST qui peut être utilisé à partir du site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ avec les paramètres indiqués par défaut sur ce site. Les séquences obtenues peuvent alors être exploitées (e.g. alignées) en utilisant par exemple les programmes CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALTN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), avec les paramètres indiqués par défaut sur ces sites.
[0031] Alternativement il est possible d'utiliser le programme CD-Search-(hthp://www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) qui permet d'identifier des domaines conservés dans les séquences protéiques d'E. coli ou de S. cerevisiae, et de rechercher des séquences d'autres microorganismes, présentant le ou les même(s) domaine(s). Les domaines conservés sont répertoriés dans la base de données CDD (Conserved domain database ; Marchler-Bauer A, Anderson JB, DeWeese-Scott C, Fedorova ND, Geer LY, He S, Hurwitz DI, Jackson JD, Jacobs AR, Lanczycki CJ, Liebert CA, Liu C, Madej T, Marchler GH, Mazumder R, Nikolskaya AN, Panchenko AR, Rao BS, Shoemaker BA, Simonyan V, Song JS, Thiessen PA, Vasudevan S, Wang Y, Yamashita RA, Yin JJ, Bryant SH. CDD: a curated Entrez database of conserved domain alignments. Nucleic Acids Research 31:383-387 (2003)) qui regroupe les données de type PFAM ou COG.
[0032] Les PFAM (Protein FAMilies database of alignments and hidden markov models ; hnp://www.sanger.ac.uk-/Software/Pfam/) représentent une large collection d'alignements de séquences protéiques. Chaque PFAM permet de visualiser des alignements multiples, de voir des domaines protéiques, d'évaluer la répartition entre les organismes, d'avoir accès à d'autres bases de données, de visualiser des structures connues de protéines.
[0033] Les COGs (Clusters of Orthologous Groups of proteins ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG sont obtenus en comparant les séquences protéiques issus de 43 génomes complètement séquencés représentant 30 lignées phylogénétiques majeurs. Chaque COG est défini à partir d'au moins trois lignées ce qui permet ainsi d'identifier des domaines conservés anciens.
[0034] À partir des séquences consensus identifiées par ces différentes méthodes, il est possible de dessiner des sondes oligonucléotidiques dégénérées permettant de cloner le gène correspondant chez un autre microorganisme. Ces techniques de routine de biologie moléculaire sont bien connues dans l'art et sont décrites par exemple dans Sambrook et al. (1989 Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
Exemples de gènes codant pour des protéines analogues à la transhydrogénase soluble d'E. coli codée par le gène udhA:
[0035]
Gènes Microorganismes
sth Azotobacter vinelandii
udhA Salmonella typhimurium LT2
sthA Pseudomonas aeruginosa PA01
sth Pseudomonas fluorescens
sthA Pseudomonas putida KT2440
udhA Shigella flexneri 2a str. 301
sthA Vibrio cholera
sthA Yersinia pestis
Exemples de gènes codant pour des protéines analogues à la quinone oxidoréductase d'E. coli codée par le gène qor:
[0036]
Gènes Microorganismes
qor Bradyrhizobium japonicum USDA 110
qor Brucella suis 1330
CC3759 Caulobacter crescentus
mll0505 Mesorhizobium loti
qor Mycobacterium tuberculosis H37RV
qor Pseudomonas aeruginosa
ZTA1 S. cerevisiae
SPCC285.01c Schizosaccharomyces pombe
drgA Synechocystis sp. PCC6803
qorA Staphylococcus aureus
TTC0305 Thermus thermophilus H B8
qor Yersinia pestis CO92
[0037] Les souches optimisées selon l'invention (i.e. capacité accrue de réduction du NADP ) comprennent la délétion d'au moins un gène codant pour une activité oxydant le NADPH, et en particulier, la délétion d'un gène codant pour une Quinone oxidoréductase (e.g. qor, ZTA1) et/ou d'un gène codant pour une activité Transhydrogénase soluble (e.g. udhA).
[0038] Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les gènes udhA et qor sont tous deux délétés.
[0039] Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les souches optimisées selon l'invention comprennent également la délétion d'un ou plusieurs gène(s) codant pour les activités Phosphoglucose isomérase (e.g. pgi, PG11) et/ou Phosphofructokinase (e.g. pfkA, PFK1).
[0040] Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, les souches optimisées selon l'invention comprennent également la modification d'un ou plusieurs gène(s) codant pour les activités Dihydrolipoamide déshydrogénase (e.g. lpd, LPD1) et/ou Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (e.g. gapA, TDH1), la modification consistant à modifier la préférence de l'enzyme au profit du NADP au lieu du NAD, son cofacteur habituel.
[0041] Les souches selon l'invention ayant la délétion des gènes codant pour les activités Phosphoglucose isomérase et/ou Phosphofructokinase sont plus particulièrement adaptées pour les procédés de biotransformation.
[0042] Pour augmenter davantage la quantité de NADPH disponible dans les microorganismes optimisés selon l'invention, il peut être également avantageux de surexprimer au moins un gène codant pour une activité enzymatique parmi la Glucose 6-phosphate déshydrogénase (e.g. zwf, ZWF1), la 6-Phosphogluconolactonase (e.g. SOL1), la 6-Phosphogluconate déshydrogénase (e.g. gnd, GND1), l'Isocitrate déshydrogénase (e.g. icd, IDP1) et la Transhydrogénase membranaire (e.g. pntA), et/ou de déléter au moins un gène codant pour une activité enzymatique parmi la 6-Phosphogluconate déshydratase (e.g. edd), la Malate synthase (e.g. aceB, DAL7), l'Isocitrate lyase (e.g. aceA, ICL1) et l'Isocitrate déshydrogénase kinase/phosphatase (e.g. aceK).
[0043] La présente invention a également pour objet un microorganisme optimisé pour la production de NADPH telle que définie ci-dessus et ci-après, lequel comprend également, un ou plusieurs gènes codant pour des activités enzymatiques impliquées dans la biotransformation d'une molécule d'intérêt, ainsi qu'un ou plusieurs gènes marqueurs de sélection.
[0044] Ces gènes peuvent être natifs de la souche optimisée selon l'invention ou encore introduits dans la souche optimisée selon l'invention par transformation avec un vecteur approprié, soit par intégration dans le génome du microorganisme ou encore par un vecteur réplicatif, ledit vecteur approprié portant un ou plusieurs gènes codant pour lesdites enzymes impliqués dans la biotransformation de ladite molécule d'intérêt et/ou lesdits marqueurs de sélection.
[0045] Ces gènes comprennent une séquence d'acide nucléique codant pour une enzyme impliquée dans la biotransformation de la molécule d'intérêt et/ou pour un marqueur de sélection, la séquence codante étant fusionnée à des séquences promotrices efficaces dans la cellule procaryote et/ou eucaryote choisie pour la biotransformation. Le vecteur (ou plasmide) peut-être un vecteur navette entre E. coli et un autre microorganisme.
[0046] Le choix de la souche optimisée pour le ratio NADPH/NADP sera déterminé en fonction du type de biotransformation (fermentation ou bioconversion), de la demande totale en NADPH de la voie de bioconversion considérée, de la nature de(s) source(s) carbonée(s), de la demande en flux de biomasse; ...
[0047] La délétion des gènes codant pour les activités Phosphoglucose isomérase et/ou Phosphofructokinase devrait s'imposer lorsque l'on n'est pas capable de maîtriser la répartition du flux de carbone entre la glycolyse et la voie des pentoses phosphate. La délétion des gènes codant pour la Phosphoglucose isomérase sera préférentiellement retenue pour les fermentations ou lorsque la demande en NADPH nécessite, au minimum, un flux de réduction de 2 moles de NADP par mole de glucose importée. La délétion des gènes codant pour la Phosphofructokinase sera préférentiellement choisie pour les bioconversions ou lorsque la demande en NADPH nécessite, au minimum, un flux de réduction de 3-4 moles de NADP par mole de glucose importée. La modification, telle que décrite ci-dessus et ci-après, des gènes codant pour les activités Dihydrolipoamide déshydrogénase et/ou Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase sera réalisée lorsque les biotransformations nécessiteront un flux de réduction, au minimum, supérieur à 3 moles de NADP par mole de glucose importé et notamment, pour optimiser les souches E. coli Δ(udhA, qor) ou E. coli Δ(udhA, qor, pgi) ou E. coli Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB). Les autres modifications citées, à savoir la surexpression d'au moins un gène codant pour une activité enzymatique parmi la Glucose 6-phosphate déshydrogénase, la 6-Phosphogluconolactonase, la 6-Phosphogluconate déshydrogénase, l'Isocitrate déshydrogénase et la Transhydrogénase membranaire, et/ou la délétion d'au moins un gène codant pour une activité enzymatique parmi la 6-Phosphogluconate déshydratase, la Malate synthase, l'Isocitrate lyase et l'Isocitrate déshydrogénase kinase/phosphatase, pourront être réalisées afin d'affiner l'optimisation du ratio NADPH/NADP aux besoins de la cellule et du procédé de biotransformation considéré.
[0048] La présente invention concerne également un procédé de préparation des souches optimisées selon l'invention telle que définie ci-dessus et ci-après, dans lequel on délète un gène pris parmi ceux codant pour les activités Quinone oxidoréductase et Transhydrogénase soluble, et le cas échéant on délète un gène pris parmi ceux codant pour les activités Glucose 6-phosphate déshydrogénase et 5-Phosphogluconolactonase, et/ou on modifie au moins un gène codant des enzymes à NAD, en particulier pour les activités Dihydrolipoamide déshydrogénase et Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, afin qu'elles utilisent préférentiellement le NADP, et le cas échéant on délète au moins un gène choisi parmi ceux codant pour les activités 6-Phosphogluconate déshydratase, Malate synthase, Isocitrate lyase et Isocitrate déshydrogénase kinase/phosphatase, ces délétions et modifications étant réalisées par un moyen approprié, et/ou on surexprime au moins un gène choisi parmi ceux codant pour les activités Glucose 6-phosphate déshydrogénase, 6-Phosphogluconolactonase, 6-Phosphogluconate déshydrogénase, Isocitrate déshydrogénase et Transhydrogénase membranaire, soit en transformant la souche avec un vecteur approprié permettant la surexpression, soit en modifiant la force du promoteur endogène contrôlant le gène à surexprimer.
[0049] Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé de préparation des souches selon l'invention comprend également la transformation des souches optimisées avec au moins un vecteur approprié comprenant un ou plusieurs gène(s) codant une ou des enzyme(s) impliqués dans la biotransformation d'une molécule d'intérêt, ainsi qu'un ou plusieurs gène(s) marqueur(s) de sélection.
[0050] Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de ces souches optimisées selon l'invention pour les biotransformations NADPH-dépendantes permettant ainsi une amélioration du rendement de biotransformation par rapport à une souche non optimisée pour le NADPH.
[0051] Les biotransformations seront réalisées en utilisant des souches définies selon l'invention dans lesquelles seront exprimés des gènes codants pour des activités enzymatiques catalysant des réactions NADPH-dépendantes. L'homme du métier saura aisément identifier de telles enzymes, on citera pour exemples et sans que cette liste soit limitative les enzymes suivantes : EC 1.1.1.10 L-xylulose réductase, EC 1.1.1.21 méthylglyoxal réductase, EC 1.1.1.51 3(or 17)β-hydroxystéroide déshydrogénase, EC 1.1.1.54 allyl-alcohol déshydrogenase, EC 1.1.1.80 isopropanol déshydrogénase, EC 1.1.1.134 dTDP-6-déoxy-L-talose 4-déshydrogénase, EC 1.1.1.149 20α-hydroxystéroide déshydrogénase, EC 1.1.1.151 21-hydroxystéroide déshydrogénase, EC 1.1.1.189 prostaglandine-E2 9-réductase, EC 1.1.1.191 indole-3-acétaldehyde réductase EC 1.1.1.207 (-)-menthol déshydrogénase, EC 1.1.1.234 flavanone 4-réductase, EC 1.2.1.50 long-chain-fatty-acyl-CoA réductase, EC 1.3.1.4 cortisone α-réductase, EC 1.3.1.23 cholesténone 5β-réductase, EC 1.3.1.70 Δ14-stérol réductase, EC 1.4.1.12 2,4-diaminopentanoate déshydrogénase, EC 1.5.1.10 saccharopine déshydrogénase, L-glutamate-forming, EC 1.7.1.6 azobenzène réductase, EC 1.8.1.5 2-oxopropyl-CoM réductase (carboxylating), EC 1.10.1.1 trans-acénaphthène-1,2-diol déshydrogénase, EC 1.14.13.7 phenol 2-monooxygénase, EC 1.14.13.12 benzoate 4-monooxygénase, EC 1.14.13.26 phosphatidylcholine 12-monooxygénase, EC 1.14.13.64 4-hydroxybenzoate 1-hydroxylase, EC 1.14.13.70 stérol 14-déméthylase, EC 1.16.1.5 aquacobalamine réductase, EC 1.17.1.1 CDP-4-déhydro-6-déoxyglucose réductase, EC 1.18.1.2 ferredoxine-NADP réductase.
[0052] L'invention concerne aussi un procédé de production d'une molécule d'intérêt dont au moins une des réactions de la voie de biosynthèse est NADPH-dépendante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) mise en culture des microorganismes optimisés selon l'invention dans un milieu de culture approprié favorisant leur croissance et comprenant les substances nécessaires pour la réalisation de la biotransformation par fermentation ou biotransformation, à l'exception du NADPH, et
b) extraction de la molécule d'intérêt du milieu et le cas échéant purification.
[0053] De manière préférentielle, la molécule d'intérêt est choisie parmi les acides aminés, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les acides gras, les acides organiques, les polyols, les hydroxyesters. Pour les acides aminés ou leurs précurseurs on citera en particulier la lysine, la méthionine, la thréonine, la proline, l'acide glutamique, l'homosérine, l'isoleucine, la valine. Pour les vitamines ou leurs précurseurs on citera notamment le pantoate, le transneurosporène, la phylloquinone, les tocophérols. Pour les stérols on citera notamment le squalène, le cholestérol, la testostérone, la progestérone, la cortisone. Pour les flavonoïdes on citera notamment la frambinone et la vestitone. Pour les acides organiques on citera l'acide coumarique, l'acide 3-hydroxypropionique. Pour les polyols on citera le sorbitol, le xylitol, le glycérol. Pour les hydroxyesters on citera l'éthyl-3-hydroxybutyrate, l'éthyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate.
[0054] Dans le cas d'une bioconversion, le procédé comprend aussi l'ajout du substrat à « convertir » dans le milieu de culture approprié.
[0055] Le milieu de culture cité à l'étape b) du procédé selon l'invention définie ci-dessus comprend au moins un carbohydrate assimilable choisi parmi différents sucres assimilables, tels le glucose, le galactose, le saccharose, le lactose, ou les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres. Une source de carbone simple tout particulièrement préférée est le glucose. Une autre source de carbone simple préférée est le saccharose. Le milieu de culture peut en outre contenir une ou plusieurs substances (e.g. acides aminés, vitamines, sels minéraux, ...) favorisant la croissance du microorganisme et/ou la production de la molécule d'intérêt. En particulier, le milieu minéral de culture pour E. coli pourra ainsi être de composition identique ou similaire à un milieu M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128), un milieu M63 (Miller, 1992 ; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou un milieu tel que défini par Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270 : 88-96).
[0056] La définition des conditions de biotransformation est du ressort de l'homme du métier. On fermente notamment les microorganismes à une température comprise entre 20°C et 55°C, de préférence entre 25°C et 40°C, plus particulièrement d'environ 30°C pour S. cerevisiae et d'environ 37°C pour E. coli.
[0057] Les exemples ne sont donnés qu'à titre d'illustration de l'invention et ne limitent en aucun le mode de réalisation ni la portée de l'invention.
Exemple 1 : Calcul des rendements optimaux théoriques de bioconversion de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate
a) bioconversion avec E. coli
[0058] Des modélisations prédictives sont réalisées en utilisant l'algorithme MetOpt®-Coli, un modèle stoechiométrique développé par la société METabolic EXplorer, qui permet de définir 1) le rendement maximal de production en éthyl-3-hydroxybutyrate à partir de l'éthylacétoacétate 2) la meilleure distribution de flux à partir du glucose pour assurer les besoins de croissance et d'équilibres redox nécessaires pour le développement de la cellule et l'atteinte du rendement maximal de bioconversion.
[0059] Les paramètres imposés au modèle sont notamment 1) un flux d'import de glucose à 3 mmol.g-1.h-1, 2) un taux de croissance variable de 0, 0.15 et 0.25 h-1, 3) un flux de la transhydrogénase membranaire (pntAB) variable et inférieur ou égal à 1 mmol.g-1.h-1. La valeur limite de flux de la transhydrogénase membranaire est déterminée à partir de la littérature (Hanson, 1979 ; Anderlund et al., 1999 ; Emmerling et al., 2002) ; 4) le flux de maintenance a été limité entre 5 et 22 mmol.g-1.h-1.
[0060] Dans tous les cas le modèle suggère la délétion des gènes udhA et qor. En pratique toutefois, la souche E. coli [Δ(udhA, qor)] ne permettra pas d'obtenir un rendement équivalent au rendement optimum théorique, car il sera difficile de maintenir la répartition adéquate de flux de carbone entre la voie des pentoses phosphate et celle de la glycolyse, cette répartition étant variable avec le taux de croissance. En pratique, on préférera donc utiliser les souches E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB)] ou [Δ(udhA, qor, pgi)], le choix entre ces deux souches étant fonction du taux de croissance de la souche lors du procédé de bioconversion.
[0061] Les rendements optimaux théoriques de bioconversion de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate ont été calculés pour différentes souches de E. coli optimisées selon l'invention :
µ = 0 µ=0,15 h-1 N=0,25h-1
Δ(udhA, qor, pgi) 1,82 1,74 1,22
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dépendant 4,29 3,64 2,43
Δ(udhA, qor, pgi) lpd-NADP dépendant 5,67 3,46 1,99
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dépendant
lpd-NADP dépendant 6,86 4,96 3,33
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) 6,76 4,65 0,19
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dépendant 8,16 5,54 1,02
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) lpd-NADP dépendant 8,33 5,60 1,77
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dépendant lpd-NADP dépendant 9,33 6,38 2,60
Rendements optimaux théoriques de bioconversion de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate (mol par mol de glucose) par des souches d'E. coli optimisées dans leur capacité de réduction du NADP
[0062] Afin d'améliorer encore le rendement optimal théorique des souches optimisées selon l'invention, des modifications supplémentaires peuvent être prises en compte, telles que la surexpression d'au moins un gène choisi parmi zwf, gnd, pntA, pntB et icd et/ou la délétion d'au moins un gène choisi parmi edd, aceA, aceB et aceK.
b) bioconversion avec S. cerevisiae
[0063] Les modélisations prédictives sont réalisées en utilisant l'algorithme MetOpt®-Scere, un modèle stoechiométrique développé par la société, qui permet de définir 1) le rendement maximal de production en éthyl-3-hydroxybutyrate à partir de l'éthylacétoacétate 2) la meilleure distribution de flux à partir du glucose pour assurer les besoins de croissance et d'équilibres redox nécessaire pour le développement de la cellule et l'atteinte du rendement maximal de bioconversion.
[0064] Les paramètres imposés au modèle sont notamment 1) un flux d'import de glucose à 3 mmol.g-1.h-1, 2) un taux de croissance variable de 0, 0.15 et 0.25 h-1, 3) un flux de maintenance inférieur ou égal à 22 mmol.g-1.h-1; 4) les réactions des aldéhydes déshydrogénases (ALD2, ALD3, ALD6) sont irréversibles et imposées dans le sens acétate NAD(P)H → acétaldehyde NAD(P) ; 5) la levure ne possède pas d'activités équivalentes à udhA ou pntA,B.
[0065] Le modèle permet de prendre en compte la compartimentation mitochondriale et peroxisomale.
[0066] Dans tous les cas, le modèle suggère la délétion d'un gène codant pour une enzyme oxydant le NADPH et en particulier, du gène ZTA1. En pratique toutefois, la souche S. cerevisiae [AZTA1] ne permettra pas d'obtenir un rendement équivalent au rendement optimum théorique, car il sera difficile de maintenir la répartition adéquate de flux de carbone entre la voie des pentoses phosphate et celle de la glycolyse, cette répartition étant variable avec le taux de croissance. En pratique, on préférera donc utiliser les souches S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2)] ou [Δ(ZTA1, PGI1)], le choix entre ces deux souches étant fonction du taux de croissance de la souche lors du procédé de bioconversion.
[0067] Les rendements optimaux théoriques de bioconversion de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate ont été calculés pour différentes souches de S. cerevisiae optimisées selon l'invention :
µ = 0 µ=0,15h-1 µ=0,25 h-1
Δ(ZTA1,PGI1) 2,42 2,00 1,73
Δ(ZTA1,PGI1) TDH1,2,3-NADP dépendant 4,22 3,50 3,03
Δ(ZTA1,PGI1) LPD1-NADP dépendant 4,08 3,29 2,77
Δ(ZTA1,PGI1) TDH1,2,3-NADP dépendant LPD1-NADP dépendant 6,17 5,01 4,23
Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) 12,00 8,18 5,64
Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) TDH1,2,3-NADP-dépendant 12,00 9,11 7,19
Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) LPD1-NADP dépendant 12,00 8,44 6,06
Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) TDH1,2,3-NADP dépendant LPD1-NADP dépendant 12,00 9,28 7,46
Rendements optimaux théoriques de bioconversion de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate (mol par mol de glucose) par des souches de S. cerevisiae optimisées dans leur capacité de réduction du NADP
[0068] Afin d'améliorer encore le rendement optimal théorique des souches optimisées selon l'invention, des modifications supplémentaires peuvent être prises en compte, telles que la surexpression d'au moins un gène choisi parmi ZWF, SOL1, SOL2, SOL3, SOL4, GND1, GND2, IDP1, IDP2 et IDP3 et/ou la délétion d'au moins un gène choisi parmi ICL1, DAL7.
Exemple 2 : Construction de la souche E. coli [Δ(udhA, qor)]
[0069] L'inactivation du gène udhA est réalisée par recombinasion homologue d'après la technique décrite par Datsenko et Wanner (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2000, 97 : 6640-6645).
[0070] Cette technique consiste à insérer une cassette de résistance à un antibiotique (chloramphénicol) tout en délétant la majeure partie du gène concerné. Pour cela on synthétise une paire d'oligonucléotides, chacun étant constitués de 100pb dont 80pb (minuscules) sont homologues avec le gène à déléter (e.g. udhA) et 20pb (majuscules) sont homologues avec la cassette de résistance au chloramphénicol :
DudhAF
DudhAR
[0071] La cassette antibiotique portée par le plasmide pKD3 est amplifiée par PCR en utilisant les oligonucléotides DudhAF et DudhAR. Le produit PCR obtenu est alors introduit par électroporation dans la souche E. coli [pKD46], qui porte le gène codant la Red recombinase; enzyme catalysant la recombinaison homologue. Les transformants résistants au chloramphénicol sont alors sélectionnés et l'insertion de la cassette de résistance est vérifiée par une analyse PCR en utilisant les oligonucléotides UdhAF et UdhAR :
UdhaF
Ggccgctcaggatatagccagataaatgac
UdhaR
Gcgggatcactttactgccagcgctggctg
[0072] La cassette de résistance au chloramphénicol est ensuite éliminée. Pour cela, le plasmide pCP20 porteur de la recombinase FLP agissant au niveau des sites FRT de la cassette de résistance au chloramphénicol, est introduit dans les souches recombinantes par électroporation. Puis, après une série de cultures à 42°C, la perte de la cassette de résistance à l'antibiotique est vérifiée par une analyse PCR avec les oligonucléotides UdhAF et UdhAR.
[0073] L'inactivation du gène qor est réalisée selon la même technique en utilisant les oligonucléotides suivants :
DqorF
DqorR
QorF
Cgcccaacaccgactgctccgcttcgatcg
QorR
cagcgttatgaccgctggcgttactaaggg
[0074] Pour des raisons pratiques, il peut être intéressant de déléter les deux gènes simultanément. Pour cela chaque gène est remplacé par une cassette de résistance à un antibiotique différent (par exemple chloramphénicol pour udhA et kanamycine pour qor).
[0075] La souche obtenue est donc E. coli [Δ(udhA, qor)].
Exemple 3 : Construction du plasmide pSK-PgapA-GRE2p, introduction dans la souche E. coli [Δ(udhA, qor)] et biotransformation de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate
[0076] Le plasmide pSK-PgapA est construit par insertion du promoteur gapA dans le vecteur pBluescript-SK (pSK). Pour cela, le promoteur gapA d'E. coli est amplifié avec la polymerase Pwo à partir de l'ADN chromosomique.
[0077] Le produit PCR obtenu est ensuite digéré par l'enzyme de restriction HindIII et ligaturé au vecteur pSK digéré par l'enzyme de restriction HindIII et déphosphorylé pour donner le plasmide pSK-PgapA. Le vecteur pSK porte une origine de réplication pour E. coli et un gène de résistance à l'ampicilline.
[0078] Le plasmide pSK-PgapA est alors introduit dans la souche E. coli DH5α pour vérification de la construction. Le séquençage du promoteur gapA du plasmide pSK-PgapA avec l'oligonucléotide universel M13 forward est ensuite réalisé pour confirmer la construction.
[0079] Le plasmide pSK-PgapA-GRE2p est construit par insertion du gène GRE2p dans le plasmide pSK-PgapA. Pour cela, le gène GRE2p de Saccharomyces cerevisiae est amplifié avec la polymerase Pwo à partir de l'ADN chromosomique en utilisant les oligonucléotides suivants :
Ome 119_GRE2F (Ndel)
Acgtacgtggcatatgtcagttttcgtttcaggtgctaacggg
Ome120_GRE2R (PstI)
Acgtacctgcagttatattctgccctcaaattttaaaatttggg
[0080] Le produit PCR obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction NdeI - PstI et ligaturé au vecteur pSK-PgapA digéré par les enzymes de restriction NdeI - PstI et déphosphorylé pour donner le plasmide pSK-PgapA-GRE2p. Le plasmide pSK-PgapA porte une origine de réplication pour E. coli et un gène de résistance à l'ampicilline.
[0081] Le plasmide pSK-PgapA-GRE2p est alors introduit dans la souche E. coli DH5α pour vérification de la construction. Le séquençage du gène GRE2p du plasmide pSK-PgapA-GRE2p avec les oligonucléotides universels M13 reverse et M13 forward est ensuite réalisé pour confirmer la construction.
[0082] Le plasmide validé est alors introduit dans la souche E. coli [Δ(udhA, qor)] (exemple 2) par électroporation.
[0083] La souche obtenue E. coli [Δ(udhA, qor) pSK-PgapA-GRE2p] est alors cultivée en milieu minimum contenant du glucose et de l'éthylacétoacétate. Une souche d'E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] est cultivée dans les mêmes conditions.
[0084] Lorsque les cultures sont achevées on compare :
l'évolution de la biomasse de chaque souche pendant la phase de bioconversion,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate produit dans le milieu extracellulaire,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate accumulé dans les cellules,
la productivité en éthyl-3-hydroxybutyrate,
le rendement glucose/éthyl-3-hydroxybutyrate.
[0085] On pourra observer que la souche E. coli [Δ(udhA, qor) pSK-PgapA-GRE2p] présente un rendement de production d'éthyl-3-hydroxybutyrate accru par rapport à la souche non optimisée.
Exemple 4 : Construction de la souche E. coli [Δ(udhA,qor,pgi) pSK-PgapA-GRE2p] et biotransformation de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutvrate
[0086] L'inactivation du gène pgi est conduite dans la souche E. coli [Δ(udhA, qor)] (exemple 2) en utilisant la technique décrite dans l'exemple 2, et les oligonucléotides suivants :
DpgiF
DpgiR
pgiF
gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc
pgiR
cggtatgatttccgttaaattacagacaag
[0087] La construction est réalisée en milieu riche (e.g. LB). On introduit alors dans la souches obtenue le plasmide pSK-PgapA-GRE2p (exemple 3) par électroporation, et la souche résultante E. coli [Δ(udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p] est sélectionnée sur milieu riche.
[0088] La souche obtenue est alors cultivée en milieu minimum contenant du glucose et de l'éthylacétoacétate. Une souche d'E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] est cultivée dans les mêmes conditions.
[0089] Lorsque les cultures sont achevées on compare :
l'évolution de la biomasse de chaque souche pendant la phase de bioconversion,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate produit dans le milieu extracellulaire,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate accumulé dans les cellules,
la productivité en éthyl-3-hydroxybutyrate,
le rendement glucose/éthyl-3-hydroxybutyrate.
[0090] On pourra observer que la souche E. coli [Δ(udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p] présente un rendement de production d'éthyl-3-hydroxybutyrate accru par rapport à la souche non optimisée.
molEHB/molGlucose
MG1655 pSK-PgapA-GRE2p 0,75
MG1655 Δ(udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p 2,12
Exemple 5 : Construction de la souche E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] et biotransformation de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate
[0091] L'inactivation du gène edd est conduite dans la souche E. coli [Δ(udhA, qor, pgi)] (exemple 4) en utilisant la technique décrite dans l'exemple 2, et les oligonucléotides suivants :
DeddF (1932582-1932499)
DeddR (1930866-1930943)
EddF (1932996-1932968)
Gggtagactccattactgaggcgtgggcg
EddR (1930439-1930462)
Ccccggaatcagaggaatagtccc
[0092] La construction est réalisée en milieu riche (e.g. LB). On introduit alors dans la souche obtenue E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd)] le plasmide pSK-PgapA-GRE2p (exemple 3) par électroporation, et la souche résultante E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] est sélectionnée sur milieu riche.
[0093] La souche obtenue E. coli [A(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] est alors cultivée en milieu minimum contenant du glucose et de l'éthylacétoacétate. Une souche E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] est cultivée dans les mêmes conditions.
[0094] Lorsque les cultures sont achevées on compare :
l'évolution de la biomasse de chaque souche pendant la phase de bioconversion,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate produit dans le milieu extracellulaire,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate accumulé dans les cellules,
la productivité en éthyl-3-hydroxybutyrate,
le rendement glucose/éthyl-3-hydroxybutyrate.
[0095] On pourra observer que la souche E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] présente un rendement de production d'éthyl-3-hydroxybutyrate accru par rapport à la souche non optimisée.
Exemple 6 : Construction de la souche E. coli [Δ(udhA, gor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] et biotransformation de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxvbutyrate
[0096] L'inactivation des gènes pfkA et pfkB est conduite dans la souche E. coli [Δ(udhA, qor)] (exemple 2) en utilisant la technique décrite dans l'exemple 2, et les oligonucléotides suivants :
DpfkAF
DpfkAR
PtkAF
Cgcacgcggcagtcagggccgacccgc
PfkAR
ccctacgccccacttgttcatcgcccg
DpfkBF (1804421-1804499)
DpfkBR (1805320-1805241)
PfkBF (1803996-1804025)
tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg
PfkBR (1805657-1805632)
gccggttgcactttgggtaagccccg
[0097] La construction est réalisée en milieu riche (e.g. LB). On introduit alors dans la souche obtenue E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB)] le plasmide pSK-PgapA-GRE2p (exemple 3) par électroporation, et la souche résultante E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] est sélectionnée sur milieu riche.
[0098] La souche obtenue E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] est alors cultivée en milieu minimum contenant du glucose et de l'éthylacétoacétate. Une souche E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] est cultivée dans les mêmes conditions.
[0099] Lorsque les cultures sont achevées on compare :
l'évolution de la biomasse de chaque souche pendant la phase de bioconversion,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate produit dans le milieu extracellulaire,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate accumulé dans les cellules,
la productivité en éthyl-3-hydroxybutyrate,
le rendement glucose/éthyl-3-hydroxybutyrate.
[0100] On pourra observer que la souche E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] présente un rendement de production d'éthyl-3-hydroxybutyrate accru par rapport à la souche non optimisée.
molEHB/molGlucose
MG1655 pSK-PgapA-GRE2p 0,75
MG1655 Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p 3,46
Exemple 7 : Construction de la souche E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd) plpd*, pSK-PgapA-GRE2p] et biotransformation de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hvdroxybutyrate
[0101] Le gène lpd codant la dihydrolipoamide déshydrogénase NAD-dépendante, impliquée dans le complexe multienzymatique pyruvate déshydrogénase, est délété en utilisant la technique décrite dans l'exemple 2 sauf que la souche initiale est la souche E. coli [Δ(udhA, qor, pgi)] décrite dans l'exemple 4 au lieu d'être une souche sauvage. La construction et la sélection de la souche modifiée est réalisée en milieu riche (e.g. LB). La souche obtenue est E.coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)].
[0102] Par ailleurs on construit le plasmide p-lpd* qui permet la surexpression d'une dihydrolipoamide déshydrogénase NADP-dépendante. Il existe différentes possibilités pour modifier la spécificité de cofacteur d'une enzyme. Par exemple Bocanegra et al. (1993) divulguent une méthode pour créer une dihydrolipoamide déshydrogénase NADP-dépendante.
[0103] Les plasmides p-lpd* et pSK-PgapA-GRE2p sont alors introduit par électroporation dans la souche E.coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)], alternativement, on peut choisir de cloner lpd* sur pSK-PgapA-GRE2p ; on obtiendrait alors le plasmide pSK-PgapA-GRE2p-lpd* que l'on introduirait par éléctroporation dans la souche E.coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)]. La construction et la sélection de la souche modifiée est réalisée en milieu riche (e.g. LB).
[0104] La souche obtenue E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd) pSK-PgapA-GRE2p, p-lpd*)] est alors cultivée en milieu minimum contenant du glucose et de l'éthylacétoacétate. Une souche E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] est cultivée dans les mêmes conditions.
[0105] Lorsque les cultures sont achevées on compare :
l'évolution de la biomasse de chaque souche pendant la phase de bioconversion,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate produit dans le milieu extracellulaire,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate accumulé dans les cellules,
la productivité en éthyl-3-hydroxybutyrate,
le rendement glucose/éthyl-3-hydroxybutyrate.
[0106] On pourra observer que la souche E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd) pSK-PgapA-GRE2p, p-lpd*)] présente un rendement de production d'éthyl-3-hydroxybutyrate accru par rapport à la souche non optimisée.
Exemple 8 : Construction du plasmide pRSGK-GRE2p
[0107] Le plasmide pYGK est construit par insertion du promoteur Ppgk, du site de multiclonage et du terminateur cyc1 du vecteur pYPG2 dans le vecteur pBluescript-SK (pSK). Pour cela, le promoteur Ppgk, le site de multiclonage et le terminateur cyc1 sont amplifiés avec la polymerase Pfu Turbo à partir du vecteur pYPG2. Le produit PCR obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction SacII - NotI et ligaturé au vecteur pSK digéré par les enzymes de restriction tapaI - SmaI, ligaturé puis digéré par les enzymes de restriction NotI - SacII et déphosphorylé pour donner le plasmide pYGK.
[0108] Le plasmide pYGK est alors introduit dans la souche E. coli DH5α pour vérification de la construction. Le séquençage du promoteur Ppgk, du site de multiclonage et du terminateur cyc1 du plasmide pYGK avec les oligonucléotides universels M13 reverse et M13 forward est ensuite réalisé pour confirmer la construction.
[0109] Le plasmide pYGK-GRE2p est ensuite construit par insertion du gène GRE2p dans le plasmide pYGK. Pour cela, le gène GRE2p de Saccharomyces cerevisiae est amplifié avec la polymerase Pwo à partir de l'ADN chromosomique, en utilisant les oligonucléotides suivants :
Ome376_Gre2 pYGK F (SmaI)
Acgtacgtcccccggaaaaatgtcagttttcgtttcaggtgc
Ome377_Gre2 pYGK R (ApaI)
ACGTACGGGCCCTTATATTCTGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGG
[0110] Le produit PCR obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction ApaI - SmaI et ligaturé au vecteur pYGK digéré par les enzymes de restriction ApaI - SmaI et déphosphorylé pour donner le plasmide pYGK-GRE2p.
[0111] Le plasmide pYGK-GRE2p est alors introduit dans la souche E. coli DH5α pour vérification de la construction. Le séquençage du gène GRE2p du plasmide pYGK-GRE2p avec les oligonucléotides universels M13 reverse et M13 forward est ensuite réalisé pour confirmer la construction.
[0112] Le plasmide pRSGK-GRE2p est finalement obtenu par digestion des plasmides pYGK-GRE2p et pRS426 avec les enzymes de restriction NotI - SacII puis ligation.
Exemple 9 : Construction de la souche S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] et biotransformation de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate
[0113] L'inactivation du gène ZTA1 est réalisée en insérant un marqueur (résistance à un antibiotique, auxotrophie) tout en délétant la majeure partie du gène concerné. La technique utilisée est décrite par Brachmann et al. (Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisae S288C : a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications, Yeast, 1998, 14: 115-32). On peut aussi utiliser la technique décrite par Wach et al. (New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 1994, 10 : 1793-1808).
[0114] Dans tous les cas on obtient une souche finale S. cerevisiae [Δ(ZTA1)], dans laquelle le plasmide pRSGK-GRE2p (exemple 8) est alors introduit.
[0115] Alternativement, on peut aussi choisir d'introduire le plasmide pRSGK-GRE2p dans une souche Δ(ZTA1) disponible, par exemple la souche EUROSCARF Y33183 (génotype : BY4743; Mat a/α; his3D1/his3D1; leu2D0/leu2D0; lys2D0/LYS2; MET15/met15D0; ura3D0/ura3D0; YBR046c::kanMX4/YBR046c::kanMX4). II est alors possible après sporulation de récupérer une souche homozygote S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p].
[0116] La souche obtenue S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] est ensuite cultivée en milieu minimum contenant du glucose et de l'éthylacétoacétate.
[0117] La souche témoin S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] est cultivée dans les mêmes conditions.
[0118] Lorsque les cultures sont achevées on compare :
l'évolution de la biomasse de chaque souche pendant la phase de bioconversion,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate produit dans le milieu extracellulaire,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate accumulé dans les cellules,
la productivité en éthyl-3-hydroxybutyrate,
le rendement glucose/éthyl-3-hydroxybutyrate.
[0119] On pourra observer que la souche S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] présente un rendement de production d'éthyl-3-hydroxybutyrate accru par rapport à la souche non optimisée.
Exemple 10 : Construction de la souche S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] et biotransformation de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate
[0120] L'inactivation du gène PGI1 est réalisée dans la souche S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] en utilisant la technique décrite dans l'exemple 9, et les oligonucléotides suivants :
Dpgi1F
DpgilR
PgilF
GCGGGGCGGTTGTCAACGATGGGGTCATGC
Pgi1R
CGGTATGATTTCCGTTAAATTACAGACAAG
[0121] Alternativement il est possible d'utiliser une souche A(PGI1) disponible, par exemple la souche EUROSCARF Y23336 (Mat α/a ; his 3D1/his3D1; leu2D0/leu2D0; lys2D0/LYS2; MET15/met15D0; ura3D0/ura3D0; YBR196c::kanMX4/YBR196c). La souche est alors transformée par le plasmide pRSGK-GRE2p (exemple 8) puis la délétion du gène ZTA1 est réalisée en utilisant la technique décrite dans l'exemple 9.
[0122] La souche obtenue S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] est alors cultivée en milieu minimum contenant du glucose et de l'éthylacétoacétate.
[0123] La souche témoin S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] est cultivée dans les mêmes conditions.
[0124] Lorsque les cultures sont achevées on compare :
l'évolution de la biomasse de chaque souche pendant la phase de bioconversion,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate produit dans le milieu extracellulaire,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate accumulé dans les cellules,
la productivité en éthyl-3-hydroxybutyrate,
le rendement glucose/éthyl-3-hydroxybutyrate.
[0125] On pourra observer que la souche S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] présente un rendement de production d'éthyl-3-hydroxybutyrate accru par rapport à la souche non optimisée.
Exemple 11 : Construction de la souche S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] et biotransformation de l'éthylacétoacétate en éthyl-3-hydroxybutyrate
[0126] Les gènes PFK1 et PFK2 sont délétés dans la souche S. cerevisiae [Δ(ZTA1)] en utilisant la technique décrite dans l'exemple 9, et les oligonucléotides suivants :
Dpfk1F
Dpfk1R
Pfk1 int F
GCTTTCTTAGAAGCTACCTCCG
Pfk1 int R
GAACCGACAAGACCAACAATGG
Pfk2 int F
CAGTTGTACACTTTGGACCC
Pfk2 int R
GATCAGCACCAGTCAAAGAACC
[0127] La souche est alors transformée par le plasmide pRSGK-GRE2p (exemple 8).
[0128] La souche obtenue S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] est alors cultivée en milieu minimum contenant du glucose et de l'éthylacétoacétate.
[0129] La souche témoin S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] est cultivée dans les mêmes conditions.
[0130] Lorsque les cultures sont achevées on compare :
l'évolution de la biomasse de chaque souche pendant la phase de bioconversion,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate produit dans le milieu extracellulaire,
la quantité d'éthyl-3-hydroxybutyrate accumulé dans les cellules,
la productivité en éthyl-3-hydroxybutyrate,
le rendement glucose/éthyl-3-hydroxybutyrate.
[0131] On pourra observer que la souche S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] présente un rendement de production d'éthyl-3-hydroxybutyrate accru par rapport à la souche non optimisée.
molEHB/molGlucose
S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] en cours
S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] en cours
Exemple 12 : Comparaison entres valeurs expérimentales et prédictions par le modèle métabolique pour l'optimisation de la production d'éthyl-3-hydroxybutyrate par Escherichia coli
[0132] On pourra observer une bonne corrélation entre les modélisations prédictives (exemple 1) et les réalisations expérimentales décrites dans les exemples 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 et 11.
[0133] Les exemples 1 à 11 ci-dessus sont des applications particulières du brevet et n'en limitent pas l'utilisation. L'homme de l'art saura aisément adapter ces exemples pour la biotransformation de molécules ayant une synthèse NADPH-dépendante. L'algorithme MetOpt® et la stratégie d'optimisation d'un procédé de bioconversion NADPH-dépendant via l'optimisation du ratio NADPH/NADP est validé ; cela nous permet en outre de revendiquer une application élargie à toutes les biotransformations NADPH dépendantes, qui pourront être modélisées et prévues par MetOpt® ou l'un de ses dérivés, en utilisant E. coli, S. cerevisiae ou tout autre microorganisme.
Exemple 13 : Calcul des rendements optimaux théoriques dans le cadre de procédés de fermentation chez E. coli
[0134] L'exemple 12 montre que les modèles MetOpt® développés par la société sont applicables aux bioconversions et devraient plus généralement s'appliquer aux biotransformations telles que les fermentations.
[0135] A titre d'exemples, le modèle MetOpt®-Coli est appliqué à la production de cystéine ou de 3-hydroxypropionate par fermentation du glucose dans des souches d'E. coli optimisées selon l'invention. Les paramètres utilisés sont les mêmes que dans l'exemple 1, à savoir : 1) un flux d'import de glucose à 3 mmol.g-1.h-1, 2) un taux de croissance variable de 0, 0.15 et 0.25 h-1, 3) un flux de la transhydrogénase membranaire (pntAB) variable et inférieur ou égal 1 mmol.g-1.h-1. La valeur limite de flux de la transhydrogénase membranaire est déterminée à partir de la littérature (Hanson, 1979 ; Anderlund et al., 1999 ; Emmerling et al., 2002) ; 4) le flux de maintenance a été limité entre 5 et 22 mmol.g-1.h-1.
a) cas de la production de cystéine par fermentation du glucose
[0136]
µ=0 µ=0,15h-1 µ=0,25h-1
Δ(udhA, qor, pgi) 0,66 0,37 0,09
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dépendant 0,78 0,37 0,09
Δ(udhA, qor, pgi) lpd-NADP dépendant 0,78 0,37 0,09
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dépendant lpd-NADP dépendant 0,78 0,37 0,09
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) 0,40 0,18 0,01
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dépendant 0,62 0,30 0,06
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) Ipd-NADP dépendant 0,71 0,36 0,13
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dépendant lpd-NADP dépendant 0,77 0,42 0,17
Rendements optimaux théoriques de production de la cystéine par des souches d'E. coli optimisées dans leur capacité de réduction du NADP (mol par mol de glucose)
[0137] Afin d'améliorer encore le rendement optimal théorique des souches optimisées selon l'invention, des modifications supplémentaires peuvent être prises en compte, telles que la surexpression d'au moins un gène choisi parmi zwf, gnd, pntA, pntB et icd et/ou la délétion d'au moins un gène choisi parmi edd, aceA, aceB et aceK.
[0138] Dans la pratique pour obtenir de tels rendements, d'autres modifications devront être apportées aux souches optimisées selon l'invention, par exemple en surexprimant le gène cysB comme décrit dans le brevet WO0127307, ou en modifiant le gène cysE comme décrit dans le brevet EP0885962.
b) cas de la production de 3-hydroxypropionate par fermentation du glucose
[0139] La production de 3-hydroxypropionate est réalisée dans des souches d'E. coli contenant les gènes codant pour les enzymes de la voie de synthèse du 3-hydroxypropionate, par exemple la malonyl-coA reductase de Chloroflexus aurantiacus (Hügler et al., Journal of Bacteriology, 2002, 184 : 2404-2410).
µ=0 µ=0,15h-1 µ = 0,25 h-1
Δ(udhA, qor, pgi) 1,33 0,79 0,30
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dépendant 1,76 0,99 0,30
Δ(udhA, qor, pgi) lpd-NADP dépendant 1,82 0,99 0,30
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dépendant lpd-NADP dépendant 1,82 0,99 0,30
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) 1,62 0,66 0,03
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dépendant 1,76 0,79 0,07
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) Ipd-NADP dépendant 1,79 0,84 0,07
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dépendant lpd-NADP dépendant 1,79 0,84 0,07
Rendements optimaux théoriques de production de 3-hydroxypropionate par des souches d'E. coli optimisées dans leur capacité de réduction du NADP (mol par mol de glucose)
[0140] Afin d'améliorer encore le rendement optimal théorique des souches optimisées selon l'invention, des modifications supplémentaires peuvent être prises en compte, telles que la surexpression d'au moins un gène choisi parmi zwf, gnd, pntA, pntB et icd et/ou la délétion d'au moins un gène choisi parmi edd, aceA, aceB et aceK.
Exemple 14 : Calcul des rendements optimaux théoriques dans le cadre de procédés de fermentation chez S. cenevisiae ; application à la production d'hydrocortisone
[0141] L'exemple 12 montre que les modèles MetOpt® développés par la société sont applicables aux bioconversions et devraient plus généralement s'appliquer aux biotransformations telles que les fermentations.
[0142] A titre d'exemple, le modèle MetOpt®-Scere est appliqué à la production d'hydrocortisone par fermentation du glucose dans des souches de S. cerevisiae optimisées selon l'invention. Les paramètres utilisés sont les mêmes que dans l'exemple 1, à savoir : 1) un flux d'import de glucose à 3 mmol.g-1.h-1, 2) un taux de croissance variable de 0, 0.15 et 0.25 h-1, 3) un flux de maintenance inférieur ou égal à 22 mmol.g-1.h-1 ; 4) les réactions des aldéhydes déhydrogénases (ALD2, ALD3, ALD6) sont irréversibles et imposées dans le sens acétate NAD(P)H → acétaldehyde NAD(P) ; 5) la levure ne possède pas d'activités équivalentes à udhA ou pntA,B.
[0143] Le modèle permet de prendre en compte la compartimentation mitochondriale et péroxisomale.
[0144] Cette représentation des résultats permet de mettre en évidence l'apport réel de chacune des mutations apportées selon l'invention, dans l'amélioration de la production de NADPH et donc dans l'amélioration du flux de production d'hydrocortisone.
[0145] La production d'hydrocortisone est réalisée dans des souches de S. cerevisiae contenant les gènes codant pour les enzymes de la voie de synthèse de l'hydrocortisone (Szczebara et al., 2003, Nature Biotechnology, 21 : 143-149).
µ = 0 µ=0,15h-1 µ=0,25h-1
Δ(ZTA1,PGl1) 0,12 0,08 0,06
Δ(ZTA1,PGl1) TDH1,2,3-NADP dépendant 0,21 0,14 0,10
Δ(ZTA1,PGl1) LPD1-NADP dépendant 0,20 0,14 0,10
A(ZTA1, PGl1) TDH1,2,3-NADP dépendant LPD1-NADP dépendant 0,21 0,14 0,10
Rendements optimaux théoriques de production d'hydrocortisone par des souches de S. cerevisiae optimisées dans leur capacité de réduction du NADP (mol par mol de glucose)
[0146] Les souches dont les gènes PFK1 et PFK2 sont délétés sont incapables de produire de l'hydrocortisone, voire ne sont pas viables. Ceci est dû au fait que la production d'hydrocortisone est davantage limitée par la demande en carbone que par le besoin en NADPH. Une solution consiste à permettre une légère expression d'une activité de type transhydrogénase chez la levure. Cependant, les modélisations montrent que le flux de production d'hydrocortisone ne sera jamais aussi bon que dans le cas d'une délétion du gène PGI1.
[0147] Afin d'améliorer encore le rendement optimal théorique des souches optimisées selon l'invention, des modifications supplémentaires peuvent être prises en compte, telles que la surexpression d'au moins un gène choisi parmi ZWF, SOL1, SOL2, SOL3, SOL4, GND1, GN | Translation - Italian
66402/LUV
TRADUZIONE DEL TESTO DEL BREVETTO EUROPEO N. 1680504
DAL TITOLO:
"Ceppi di microorganismi ottimizzati per vie di biosintesi consumatrici di NADPH"
di: Metabolic Explorer di nazionalità francese, con sede in 63360 Saint Beauzire (Francia)
Inventori designati: Gwénaëlle BESTEL-CORRE, Cédric BOISART, Michel CHATEAU, Benjamin GONZALEZ, Philippe SOUCAILLE, Rainer FIGGE, Olivier ZINK,
Depositata il:
* * *
DESCRIZIONE
Il NADP (nicotinammide adenin dinucleotide fosfato) prende parte, nella sua forma ridotta di NADPH, alle reazioni intracellulari di ossidoriduzione che implicano degli enzimi aventi attività di deidrogenasi o riduttasi.
La presente invenzione riguarda dei ceppi di microorganismi ottimizzati per la produzione mediante biotrasformazione di molecole aventi vie di biosintesi consumatrici di NADPH. I ceppi secondo la presente invenzione sono utilizzabili in procedimenti di biotrasformazione consumatori di NADPH. I ceppi definiti secondo la presente invenzione possono essere procariotici o eucariotici. In una forma preferenziale di esecuzione, il detto ceppo procariotico è un ceppo di Escherichia coli. In un'altra forma di realizzazione, il detto ceppo eucariotico è un ceppo di Saccharomyces, in particolare S. cerevisiae.
La presente invenzione riguarda ugualmente un procedimento per la preparazione di molecole mediante biotrasformazione comprendente la coltivazione in un ambiente appropriato di un ceppo ottimizzato secondo la presente invenzione, il detto ceppo ottimizzato comprendendo anche gli elementi genetici necessari per la preparazione della detta molecola.
I procedimenti di biotrasformazione sono stati sviluppati allo scopo di permette la produzione di molecole in grandi quantità a dei costi bassi, permettendo però nello stesso tempo anche la valorizzazione dei differenti sottoprodotti industriali o dell'agricoltura.
Ai fini della produrre di molecole a cui si è interessati mediante biotrasformazione in vivo, si distingueranno due grandi approcci:
- da una parte la fermentazione che permette la produzione di molecole da parte di un microorganismo a partire da una fonte di carbonio semplice (per esempio pubblicazione brevettuale internazionale WO0102547 che descrive la produzione di lisina mediante la fermentazione di C. glutamicum in presenza di glucosio),
- d'altra parte la bioconversione da parte di un microorganismo di un co-substrato dato a dare una molecola a cui si è interessati (per esempio pubblicazione brevettuale WO0012745 che descrive la produzione di derivati della R-piperidina, WO0068397 che descrive la produzione di tagatosio). Il co-substrato non è assimilabile; esso è differente dalla fonte di carbonio che viene utilizzata unicamente allo scopo di produrre la biomassa e il NADPH necessario per la bioconversione.
Il miglioramento di un procedimento di biotrasformazione può essere incentrato su differenti fattori come la temperatura, l'ossigenazione, la composizione del terreno, il procedimento di recupero e così via. E' anche possibile concepire una modifica del microorganismo in maniera tale che venga aumentata la produzione della molecola a cui si è interessati e/o la sua escrezione.
Nel quadro di una fermentazione, ci si impegnerà per esempio ad ottimizzare la via di biosintesi, per esempio modificando la regolazione dei geni oppure modificando i geni allo scopo di modificare le caratteristiche degli enzimi implicati, o ancora ottimizzando la rigenerazione dei cofattori.
Nel quadro della bioconversione, ci si consacrerà in maniera prevalente a ridurre la formazione di co-prodotti e a ottimizzare la rigenerazione dei cofattori implicati nello stadio o negli stadi di bioconversione.
Tra i cofattori implicati nella biotrasformazione, il NADPH assume una parte importante in particolare per la produzione degli aminoacidi (per esempio arginina, prolina, isoleucina, metionina, lisina), di vitamine (per esempio pantotenato, fillochinone, tocoferolo), di molecole aromatiche (per esempio WO401564), di polioli (per esempio xilitolo), di poliammine (per esempio spermidina). di idrossiesteri (per esempio etil-4-cloro-3-idrossibutirrato) o di altre molecole ad elevato valore aggiunto.
La presente invenzione riguarda dunque un ceppo di microorganismi ottimizzato per la produzione di molecole aventi delle vie di biosintesi che consumano il NADPH, come è definito nella rivendicazione 1.
Invece di tentare di ottimizzare per ogni biotrasformazione il rapporto NADPH/NADP nel microorganismo, gli inventori hanno optato per la produzione di microorganismi modificati allo scopo di ottenere differenti rapporti NADPH/NADP , i detti microorganismi modificati venendo successivamente impiegati allo scopo di realizzare le biotrasformazioni consumatrici di NADPH.
Per ceppo di microorganismo, secondo la presente invenzione si intende un complesso di microorganismi di una stessa specie che comprende almeno un microorganismo della detta specie. Così, le caratteristiche descritte per il ceppo valgono per ciascuno dei microorganismi del detto ceppo. In ugual maniera, le caratteristiche descritte per uno dei microorganismi del ceppo si applicheranno al complesso dei detti microorganismi che lo compongono.
Tra i microorganismi ottimizzati secondo la presente invenzione, si citeranno i batteri e i lieviti, i funghi filamentosi e in particolare i batteri e i lieviti delle seguenti specie: Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacter sp., Penicillium sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp., Candida sp.
Il principio dell'ottimizzazione del rapporto NADPH/NADP viene descritto qui nel seguito per E. coli e S. cerevisiae. Lo stesso principio può venire applicato in una maniera simile a tutti i microorganismi coltivati in condizioni aerobiche.
Il principio dell'ottimizzazione del rapporto NADPH/NADP consiste nel limitare le attività enzimatiche implicate nell'ossidazione del NADPH, e nel favorire le attività enzimatiche che permettono la riduzione del NADP . Si limitano le attività enzimatiche implicate nell'ossidazione del NADPH diminuendo, e più in particolare inattivando, attività di questo genere, in particolare le attività del tipo chinone ossidoriduttasi e/o transidrogenasi solubile. Si favoriscono le attività enzimatiche che permettono la riduzione del NADP imponendo il flusso di carbonio attraverso il ciclo dei pentoso fosfato e/o modificato la specificità di cofattore di almeno un enzima in maniera tale che esso utilizzi il NADP preferenzialmente rispetto al NAD, che è il suo cofattore abituale.
I ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione vengono ottenuti mediante tecniche di biologia molecolare. Il tecnico del ramo conosce i protocolli che permettono di modificare il carattere genetico dei microorganismi. Le tecniche di trasformazione sono documentate e sono alla portata del tecnico del ramo (Sambrook et al., 1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
I procedimenti che permettono di limitare un'attività enzimatica consistono nel modificare il gene che permette la sua espressione mediante un mezzo appropriato, per esempio apportando una o più mutazioni nella parte codificante del gene interessato, oppure modificando la regione promotrice, in particolare sostituendola con una sequenza che permette di diminuire l'espressione del gene.
I procedimenti che permettono di inattivare un'attività enzimatica consistono nell'inattivare il prodotto dell'espressione del gene interessato mediante un mezzo appropriato, oppure nell'inibire l'espressione del gene interessato, o ancora nel deletare (cancellare) almeno una parte del gene interessato, in maniera da far sì che la sua espressione non si verifichi (per esempio delezione di una parte o del complesso della regione promotrice necessaria per la sua espressione), oppure che il prodotto di espressione abbia perduto la sua funzione (per esempio delezione nella parte codificante del gene interessato).
In maniera preferenziale, la delezione di un gene comprende la soppressione della parte essenziale del detto gene, e se del caso la sostituzione con un gene marcante di selezione che permette di facilitare l'identificazione, l'isolamento e la purificazione dei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione.
L'inattivazione di un gene in E. coli viene effettuata preferenzialmente mediante ricombinazione omologa (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645). Il principio di un protocollo ne viene ricordato brevemente: nella cellula si introduce un frammento lineare, ottenuto in vitro, comprendente le due regioni fiancheggianti il gene, e almeno un gene di selezione tra queste due regioni (generalmente un gene di resistenza a un antibiotico), il detto frammento lineare presentando dunque un gene inattivato. Si selezionano le cellule che hanno subito un evento di ricombinazione e che hanno integrato il frammento introdotto mediante stesura su terreno selettivo. Successivamente, vengono selezionate le cellule che hanno subito un evento di doppia ricombinazione, nelle quali il gene nativo è stato sostituito con il gene inattivato. Questo protocollo può venire migliorato utilizzando i sistemi di selezione positiva e negativa allo scopo di accelerare la rivelazione degli eventi di doppia ricombinazione.
L'inattivazione di un gene in S.cerevisiae viene effettuata di nuovo preferenzialmente mediante ricombinazione omologa (Baudin et al., Nucl. Acids Res. 21, 3329-3330, 1993; Wach et al., Yeast 10, 1793-1808, 1994; Brachmann et al., Yeast. 14:115-32, 1998).
I procedimenti che permettono di favorire un'attività enzimatica consistono nello stabilizzare il prodotto di espressione del gene interessato mediante un mezzo appropriato, per esempio diminuendo la sua sensibilità a effettori allosterici, oppure nell'aumentare l'espressione del detto gene in maniera tale da aumentare la quantità di enzima.
La sovraespressione di un gene può venire effettuata mediante sostituzione del promotore di questo gene in situ con un promotore forte o inducibile. Alternativamente, nella cellula viene introdotto un plasmide di replicazione (semplice o a copie multiple) nel quale il gene che si desidera sovraesprimere si trova sotto il controllo del promotore adeguato. Nel caso della modificazione di Escherichia coli, si potranno per esempio utilizzare i promotori Plac-o, Ptrc-o, ptac-o, tre promotori forti batterici per i quali l'operatore lac (lacO) è stato deletato allo scopo di renderli costitutivi. Nel caso di modificazioni di Saccharomyces cerevisiae, sarà per esempio possibile utilizzare i promotori Ppgk, Padh1, Pgal1, Pgal10.
I procedimenti che permettono di modificare la specificità di cofattore di un enzima in maniera tale che esso utilizzi il NADP in via preferenziale rispetto al NAD consistono nel modificare la sequenza del gene che permette l'espressione di questo enzima (Bocanegra, J.A. Scrutton, N.S.; Perham, R.N. (1993) Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering. Biochemistry 32: 2737-2740).
I ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione (cioè con una capacità aumentata di riduzione del NADP ) comprendono l'attenuazione o addirittura l'inattivazione di una o più attività enzimatiche che ossidano il NADPH, e in particolare delle attività di tipo chinone ossidoriduttasi e/o transidrogenasi solubile.
Come esempi di enzimi che ossidano il NADPH e senza che questo elenco sia limitativo, verranno citati i seguenti geni:
Attività enzimatiche Numero EC Geni E. coli Geni S. cerevisiae
Alcol deidrogenasi 1.1.1.2 yahK ADH6
Aldosio riduttasi 1.1.1.21 GRE3
Deidrogenasi di Shikimate 1.1.1.25 aroE ARO1
Metilgliossale riduttasi 1.1.1.78 GRE2p
Gamma-glutammil fosfato riduttasi 1.2.1.41 proA PRO2
2,4-dienoil coenzima A riduttasi 1.3.1.34 fadH
Glutammmato deidrogenasi 1.4.1.4 gdhA GDH1, GDH2
Glutammmato sintasi 1.4.1.13 gltB, gltD GLT1
Metilentetraidrofolato deidrogenasi 1.5.1.5 folD ADE3, MIS1
Transidrogenasi solubile 1.6.1.1 udhA
Transidrogenasi di membrana 1.6.1.2 pntA, pntB
Chinone ossidoriduttasi 1.6.5.5 qor ZTA1
Nitrito riduttasi 1.7.1.4 nirB, nirD
Solfito riduttasi 1.8.1.2 cysI, cysJ
Sterolo demetilasi 1.14.13.70 ERG11
4-Idrossi-3-metilbut-2-enil difosfato riduttasi 1.17.1.2 ispH
Flavodossina riduttasi 1.18.1.2 fpr
I ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione (cioè con una aumentata capacità di riduzione del NADP ) comprendono ugualmente modifiche che permettono di favorire una o più attività enzimatiche che riducono il NADP , e in particolare modifiche che permettono di imporre il flusso di carbonio attraverso il ciclo dei pentoso fosfati, e/o modifiche che riguardano la specificità di cofattore di almeno un enzima, in modo tale che esso utilizzi il NADP in via preferenziale rispetto al NAD, che è suo cofattore abituale.
Le attività idonee ad essere modificate nei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione (cioè con una aumentata capacità di riduzione del NADP ) allo scopo di favorire una o più attività enzimatiche riducenti il NADP sono descritte qui sotto:
Attività enzimatiche Numero EC Geni E. coli Geni S. cerevisiae
Fosfoglucosio isomerasi 5.3.1.9 pgi PGI1
Fosfofruttochinasi 2.7.1.11 pfkA, pfkB PFK1, PFK2
Glucosio 6-fosfato deidrogenasi 1.1.1.49 zwf ZWF1
6-Fosfogluconolattonasi 3.1.1.31 SOL1, SOL2, SOL3, SOL4
6-Fosfogluconato deidrogenasi 1.1.1.44 gnd GND1, GND2
6-Fosfogluconato deidratasi 4.2.1.12 edd
Malato sintasi 2.3.3.9 aceB DAL7
Isocitrato liasi 4.1.3.1 aceA ICL1
Isocitrato deidrogenasi 1.1.1.42 icd IDP1, IDP2, IDP3
Isocitrato deidrogenasi chinasi/fosfatasi 2.7.1.116 aceK
Diidrolipoammide deidrogenasi 1.8.1.4 Ipd LPD1
Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi 1.2.1.12 gapA, gapC TDH1, TDH2, TDH3
Le attività enzimatiche che possono venire modificate nei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione sono definite principalmente mediante l'impiego della denominazione della proteina o del gene in E. coli o S. cerevisiae. Tuttavia, questo impiego ha un significato più generale secondo la presente invenzione e ingloba le attività enzimatiche corrispondenti presenti in altri microorganismi. In effetti, utilizzando le sequenze delle proteine e dei geni di E. coli o di S. cerevisiae, il tecnico del ramo è in grado di determinare le proteine e i geni equivalenti in altri microorganismi differenti da E. coli o S. cerevisiae.
I mezzi di identificazione delle sequenze omologhe e delle loro percentuali di omologia sono ben noti al tecnico del ramo, e comprendono per la precisione il programma BLAST che può venire utilizzato a partire dal sito http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con i parametri indicati come standard su questo sito. Le sequenze ottenute possono allora venire sfruttate (per esempio allineate) utilizzando per esempio i programmi CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) o MULTALTN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), con i parametri indicati per difetto (standard) su questi siti.
Alternativamente, è possibile utilizzare il programma CD-Search-(http://www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) che permette di identificare domini conservati nelle sequenze proteiche di E. coli o di S. cerevisiae e di ricercare sequenze di altri microorganismi che presentano lo stesso o gli stessi domini. I domini conservati sono rubricati nella base di dati CDD (Conserved domain database; Marchler-Bauer A, Anderson JB, DeWeese-Scott C, Fedorova ND, Geer LY, He S, Hurwitz DI, Jackson JD, Jacobs AR, Lanczycki CJ, Liebert CA, Liu C, Madej T, Marchler GH, Mazumder R, Nikolskaya AN, Panchenko AR, Rao BS, Shoemaker BA, Simonyan V, Song JS, Thiessen PA, Vasudevan S, Wang Y, Yamashita RA, Yin JJ, Bryant SH. CDD: a curated Entrez database of conserved domain alignments. Nucleic Acids Research 31:383-387 (2003)) che raggruppa i dati di tipo PFAM o COG.
Le PFAM (Protein FAMilies database of alignments and hidden markov models; http://www.sanger.ac.uk-/Software/Pfam/) rappresentano una grande raccolta di allineamenti di sequenze proteiche. Ogni PFAM permette di visualizzare degli allineamenti multipli, di vedere dei domini proteici, di valutare la distribuzione tra gli organismi, di avere accesso ad altre basi di dati, di visualizzare delle strutture note di proteine.
I COGs (Clusters of Orthologous Groups of proteins; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG vengono ottenuti confrontando le sequenze proteiche derivate da 43 genomi dei quali è stata completamente determinata la sequenza e che rappresentano 30 linee filogenetiche principali. Ogni COG è definito a partire da almeno tre discendenze (linee), il che permette così di identificare dei domini conservati anziani.
A partire dalle sequenze di consenso identificate mediante questi differenti metodi, è possibile progettare delle sonde oligonucleotidiche degenerate che permettono di clonare il gene corrispondente in un altro microorganismo. Queste tecniche di routine della biologia molecolare sono ben note nel mestiere e sono descritte per esempio in Sambrook et al. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
Esempi di geni che codificano per proteine analoghe alla transidrogenasi solubile di E. coli codificata dal gene udhA:
Geni Microorganismi
sth Azotobacter vinelandii
udhA Salmonella typhimurium LT2
sthA Pseudomonas aeruginosa PA01
sth Pseudomonas fluorescens
sthA Pseudomonas putida KT2440
udhA Shigella flexneri 2a str. 301
sthA Vibrio cholera
sthA Yersinia pestis
Esempi di geni che codificano per proteine analoghe alla chinone ossidoriduttasi di E. coli codificata dal gene qor:
Geni Microorganismi
qor Bradyrhizobium japonicum USDA 110
qor Brucella suis 1330
CC3759 Caulobacter crescentus
mll0505 Mesorhizobium loti
qor Mycobacterium tuberculosis H37RV
qor Pseudomonas aeruginosa
ZTA1 S. cerevisiae
SPCC285.01c Schizosaccharomyces pombe
drgA Synechocystis sp. PCC6803
qorA Staphylococcus aureus
TTC0305 Thermus thermophilus HB8
qor Yersinia pestis CO92
I ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione (cioè aventi una capacità aumentata di riduzione del NADP ) comprendono la delezione di almeno un gene che codifica per un'attività ossidante il NADPH, e in particolare, la delezione di un gene codificante per una chinone ossidoriduttasi (per esempio qor, ZTA1) e/o di un gene codificante per un'attività di transidrogenasi solubile (per esempio udhA).
Secondo una forma preferenziale di esecuzione della presente invenzione, i geni udhA e qor sono deletati tutti e due.
Secondo una forma di realizzazione particolare della presente invenzione, i ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione comprendono ugualmente la delezione di uno o più geni che codificano per le attività di fosfoglucosio isomerasi (per esempio pgi, PGI1) e/o fosfofruttochinasi (per esempio pfkA, PFK1).
Secondo un'altra forma di realizzazione particolare della presente invenzione, i ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione comprendono anche la modificazione di uno o più geni codificanti per le attività di diidrolipoammide deidrogenasi (per esempio lpd, LPD1) e/o gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (per esempio gapA, TDH1), la modificazione consistendo nel modificare la preferenza dell'enzima a vantaggio del NADP piuttosto che il NAD, che è il suo cofattore abituale.
I ceppi secondo la presente invenzione che presentano la delezione dei geni codificanti per le attività di fosfoglucosio isomerasi e/o fosfofruttochinasi sono adatti più in particolare per i procedimenti di biotrasformazione.
Allo scopo di aumentare maggiormente la quantità di NADPH disponibile nei microorganismi ottimizzati secondo la presente invenzione, può ugualmente essere vantaggioso sovraesprimere almeno un gene codificante per un'attività enzimatica scelta tra la glucosio 6-fosfato deidrogenasi (per esempio zwf, ZWF1), la 6-fosfogluconolattonasi (per esempio SOL1), la 6-fosfogluconato deidrogenasi (per esempio gnd, GND1), la isocitrato deidrogenasi (per esempio icd, IDP1) e la transidrogenasi di membrana (per esempio pntA), e/o di deletare almeno un gene codificante per un'attività enzimatica scelta tra la 6-fosfogluconato deidratasi (per esempio edd), la malatosintasi (per esempio aceB, DAL7), la isocitrato liasi (per esempio aceA, ICL1) e l'isocitrato deidrogenasi chinasi/fosfatasi (per esempio aceK).
La presente invenzione ha ugualmente per oggetto un microorganismo ottimizzato per la produzione di NADPH come è definito qui sopra e nel seguito, il quale comprende ugualmente uno o più geni codificanti per attività enzimatiche implicate nella biotrasformazione di una molecola a cui si è interessati, nonché uno o più geni marcanti di selezione.
Questi geni possono essere nativi del ceppo ottimizzato secondo la presente invenzione oppure possono anche essere introdotti nel ceppo ottimizzato secondo la presente invenzione mediante trasformazione con un vettore appropriato o per integrazione nel genoma del microorganismo o anche per mezzo di un vettore replicantesi, il detto vettore appropriato portando uno o più geni codificanti per i detti enzimi implicati nella biotrasformazione della detta molecola a cui si è interessati e/o i detti marcanti di selezione.
Questi geni comprendono una sequenza di acido nucleico codificante per un enzima implicato nella biotrasformazione della molecola a cui si è interessati e/o per un marcante di selezione, la sequenza codificante essendo fusa con delle sequenze promotrici efficaci nella cellula procariotica e/o eucariotica scelta per la biotrasformazione. Il vettore (o plasmide) può essere un vettore navetta tra E. coli e un altro microorganismo.
La scelta del ceppo ottimizzato per il rapporto NADPH/NADP verrà determinata in funzione del tipo di biotrasformazione (fermentazione o bioconversione), della richiesta totale di NADPH della via di bioconversione considerata, della natura della fonte o delle fonti di carbonio, della richiesta di flusso di biomassa, e così via.
La delezione dei geni codificanti per le attività di fosfoglucosio isomerasi e/o fosfofruttochinasi si dovrebbe imporre quando non si è in grado di controllare la ripartizione del flusso di carbonio tra la glicolisi e la via dei pentosofosfati. La delezione dei geni codificanti per la fosfoglucosio isomerasi verrà preferenzialmente presa in considerazione per le fermentazioni oppure quando la domanda di NADPH richiede come minimo un flusso di riduzione di 2 moli di NADP per mole di glucosio importata. La delezione dei geni codificanti per la fosfofruttochinasi verrà scelta preferenzialmente per le bioconversioni oppure quando la domanda di NADPH richiede come minimo un flusso di riduzione di 3-4 moli di NADP per mole di glucosio importata. La modifica, come è descritta qui sopra e nel seguito, dei geni codificanti per le attività di diidrolipoammide deidrogenasi e/o gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi verrà realizzata quando le biotrasformazioni avranno bisogno di un flusso di riduzione superiore, come minimo, a 3 moli di NADP per mole di glucosio importato e in particolare, allo scopo di ottimizzare i ceppi E. coli Δ(udhA, qor) o E. coli Δ(udhA, qor, pgi) o E. coli Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB). Le altre modifiche citate, per la precisione la sovraespressione di almeno un gene codificante per un'attività enzimatica scelta tra la glucosio 6-fosfato deidrogenasi, la 6-fosfogluconolattonasi, la 6-fosfogluconato deidrogenasi, l'isocitrato deidrogenasi e la transidrogenasi di membrana, e/o la delezione di almeno un gene codificante per un'attività enzimatica scelta tra la 6-fosfogluconato deidratasi, la malato sintasi, l'isocitrato liasi e l'isocitrato deidrogenasi chinasi/fosfatasi, potranno venire realizzate allo scopo di affinare l'ottimizzazione del rapporto NADPH/NADP in funzione delle esigenza della cellula e del procedimento di biotrasformazione considerato.
La presente invenzione riguarda ugualmente un procedimento per la preparazione dei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione come è definita qui sopra e nel seguito nel quale viene deletato un gene selezionato tra quelli che codificano per le attività di chinone ossidoriduttasi e transidrogenasi solubile, e se del caso viene deletato un gene selezionato tra quelli che codificano per le attività glucosio 6-fosfato deidrogenasi e 5-fosfogluconolattonasi, e/o si modifica almeno un gene codificante degli enzimi a NAD, in particolare per le attività di diidrolipoammide deidrogenasi e gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi, per fare in modo che essi utilizzino preferenzialmente il NADP, e, se del caso, viene deletato almeno un gene scelto tra quelli che codificano per le attività di 6-fosfogluconato deidratasi, malato sintasi, isocitrato liasi e isocitrato deidrogenasi chinasi/fosfatasi, queste delezioni e modifiche venendo realizzate mediante un mezzo appropriato e/o si sovraesprimere un gene scelto tra quelli che codificano per le attività di glucosio 6-fosfato deidrogenasi, 6-fosfogluconolattonasi, 6-fosfogluconato deidrogenasi, isocitrato deidrogenasi e transidrogenasi di membrana, sia trasformando il ceppo con un vettore appropriato che permette la sovraespressione, sia modificando la forza del promotore endogeno che controlla il gene da sovraesprimere.
Secondo una forma di realizzazione particolare della presente invenzione, il procedimento di preparazione dei ceppi secondo la presente invenzione comprende ugualmente la trasformazione dei ceppi ottimizzati con almeno un vettore appropriato comprendente uno o più geni codificanti un enzima o più enzimi implicati nella biotrasformazione di una molecola a cui si è interessati, nonché uno o più geni marcanti di selezione.
Un altro aspetto della presente invenzione riguarda l'utilizzo di questi ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione per le biotrasformazioni NADPH-dipendenti permettendo in questo modo un miglioramento della resa di biotrasformazione rispetto ad un ceppo non ottimizzato per il NADPH.
Le biotrasformazioni verranno realizzate utilizzando dei ceppi definiti secondo la presente invenzione nei quali saranno espressi dei geni codificanti per le attività enzimatiche che catalizzano le reazioni NADPH-dipendenti. Il tecnico del ramo saprà identificare con facilità enzimi di questo tipo, come esempi, e senza che questo elenco sia limitativo, verranno citati i seguenti enzimi: EC 1.1.1.10 L-xilulosio riduttasi, EC 1.1.1.21 metilgliossale riduttasi, EC 1.1.1.51 3(or 17)β-idrossisteroide deidrogenasi, EC 1.1.1.54 allil-alcol deidrogenasi, EC 1.1.1.80 isopropanolo deidrogenasi, EC 1.1.1.134 dTDP-6-desossi-L-talosio 4-deidrogenasi, EC 1.1.1.149 20α-idrossisteroide deidrogenasi, EC 1.1.1.151 21-idrossisteroide deidrogenasi, EC 1.1.1.189 prostaglandina-E2 9-riduttasi, EC 1.1.1.191 indole-3-acetaldeide riduttasi EC 1.1.1.207 (-)-mentolo deidrogenasi, EC 1.1.1.234 flavanone 4-riduttasi, EC 1.2.1.50 long-chain-fatty-acyl-CoA riduttasi, EC 1.3.1.4 cortisone α-riduttasi, EC 1.3.1.23 colestenone 5β-riduttasi, EC 1.3.1.70 Δ14-sterolo riduttasi, EC 1.4.1.12 2,4-diamminopentanoato deidrogenasi, EC 1.5.1.10 saccaropina deidrogenasi, L-glutamate-forming, EC 1.7.1.6 azobenzene riduttasi, EC 1.8.1.5 2-ossopropil-CoM riduttasi (carboxylating), EC 1.10.1.1 trans-acenaften-1,2-diolo deidrogenasi, EC 1.14.13.7 fenolo 2-monoossigenasi, EC 1.14.13.12 benzoato 4-monoossigenasi, EC 1.14.13.26 fosfatidilcolina 12-monoossigenasi, EC 1.14.13.64 4-idrossibenzoato 1-idrossilasi, EC 1.14.13.70 sterolo 14-demetilasi, EC 1.16.1.5 aquacobalammina riduttasi, EC 1.17.1.1 CDP-4-deidro-6-desossiglucosio riduttasi, EC 1.18.1.2 ferredossina-NADP riduttasi.
La presente invenzione riguarda anche un procedimento di produzione di una molecola a cui si è interessati, almeno una delle reazioni della via di biosintesi della quale è NADPH-dipendente, caratterizzato dal fatto che esso comprende gli stadi seguenti:
a) messa in coltura di microorganismi ottimizzati secondo la presente invenzione in un terreno di coltura appropriato che favorisce la loro crescita e che comprende le sostanze necessarie per la realizzazione della biotrasformazione mediante fermentazione o biotransformazione, con l'esclusione del NADPH, e
b) estrazione della molecola a cui si è interessati dal terreno e se del caso purificazione.
In maniera preferenziale, la molecola a cui si è interessati è scelta tra gli amminoacidi, le vitamine, gli steroli, i flavonoidi, gli acidi grassi, gli acidi organici, i polioli, gli idrossiesteri. Per gli amminoacidi o i loro precursori, verranno citati in particolare la lisina, la metionina, la treonina, la prolina, l'acido glutammico, l'omoserina, l'isoleucina, la valina. Per le vitamine o i loro precursori, verranno citati in particolare il pantoato, il transneurosporene, il fillochinone, i tocoferoli. Per gli steroli, verranno citati in particolare lo squalene, il colesterolo, il testosterone, il progesterone, il cortisone. Per i flavonoidi verranno citati in particolare il frambinone e il vestitone. Per gli acidi organici, verranno citati l'acido cumarico, l'acido 3-idrossipropionico. Per i polioli verranno citati il sorbitolo, lo xilitolo, il glicerolo. Per gli idrossiesteri, verranno citati l'etil-3-idrossibutirrato, l'etil-4-cloro-3-idrossibutirrato.
Nel caso di una bioconversione, il procedimento comprende anche l'aggiunta del substrato da "convertire" nel terreno di coltura appropriato.
Il terreno di coltura citato nello stadio b) del procedimento secondo la presente invenzione definito qui sopra comprende almeno un carboidrato assimilabile scelto tra vari zuccheri assimilabili, come il glucosio, il galattosio, il saccarosio, il lattosio, o i melassi, oppure i sottoprodotti di questi zuccheri. Una fonte di carbonio semplice preferito in maniera del tutto particolare è il glucosio. Un'altra fonte di carbonio semplice preferita è il saccarosio. Il terreno di coltura può inoltre contenere una o più sostanze (per esempio amminoacidi, vitamine, sali minerali, e così via) che favoriscono la crescita del microorganismo e/o la produzione della molecola a cui si è interessati. In particolare, il terreno minerale di coltura per E. coli potrà così avere una composizione uguale o simile a quella di un terreno M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128), un terreno M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) o un terreno come è definito da Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).
La definizione delle condizioni di biotrasformazione è di competenza del tecnico del ramo. In particolare i microorganismi vengono fermentati ad una temperatura compresa tra 20°C e 55°C, di preferenza tra 25°C e 40°C, più in particolare di circa 30°C per S. cerevisiae e di circa 37°C per E. coli.
Gli esempi vengono forniti unicamente a titolo di illustrazione dell'invenzione e non limitano in niente la forma di realizzazione né la portata della presente invenzione.
Esempio 1: Calcolo delle rese ottimali teoriche di bioconversione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
a) bioconversione con E. coli
Delle modellizzazioni predittive vengono realizzate utilizzando l'algoritmo MetOpt®-Coli, un modello stechiometrico sviluppato dalla società METabolic EXplorer che permette di definire 1) la resa massima di produzione di etil-3-idrossibutirrato a partire da acetoacetato d'etile, 2) la migliore distribuzione del flusso a partire dal glucosio allo scopo di assicurare i bisogni di crescita e di equilibri ossidoriduttivi (redox) necessari per lo sviluppo della cellula e per il raggiungimento della resa massima di bioconversione.
I parametri imposti al modello sono per la precisione 1) un flusso di importazione di glucosio pari a 3 mmol.g-1.h-1, 2) un tasso di crescita variabile di 0, 0,15 e 0,25 h-1, 3) un flusso della transidrogenasi di membrana (pntAB) variabile e inferiore o uguale a 1 mmol.g-1.h-1. Il valore del flusso della transidrogenasi di membrana viene determinato a partire dalla letteratura (Hanson, 1979; Anderlund et al., 1999; Emmerling et al., 2002); 4) il flusso di mantenimento è stato limitato tra 5 e 22 mmol.g-1.h-1.
In tutti i casi, il modello suggerisce la delezione dei geni udhA e qor. In pratica, tuttavia, il ceppo E. coli [Δ(udhA, qor)] non permetterà di ottenere una resa equivalente alla resa ottimale teorica per il fatto che sarà difficile mantenere la distribuzione adeguata del flusso di carbonio tra la via dei pentoso-fosfati e quella della glicolisi, questa distribuzione essendo variabile in funzione del tasso di crescita. Nella pratica, si preferirà dunque utilizzare i ceppi E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB)] o [Δ(udhA, qor, pgi)], la scelta tra questi due ceppi essendo funzione del tasso di crescita del ceppo nel corso del procedimento di bioconversione.
Le rese ottimali teoriche di bioconversione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato sono state calcolate per diversi ceppi di E. coli ottimizzati secondo la presente invenzione:
µ = 0 µ=0,15 h-1 N=0,25h-1
Δ(udhA, qor, pgi) 1,82 1,74 1,22
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dipendente 4,29 3,64 2,43
Δ(udhA, qor, pgi) lpd-NADP dipendente 5,67 3,46 1,99
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dipendentelpd-NADP dipendente 6,86 4,96 3,33
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) 6,76 4,65 0,19
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dipendente 8,16 5,54 1,02
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) lpd-NADP dipendente 8,33 5,60 1,77
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dipendente lpd-NADP dipendente 9,33 6,38 2,60
Rese ottimali teoriche di bioconversione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato (moli per mole di glucosio) da parte di ceppi di E. coli ottimizzati per quanto riguarda la loro capacità di riduzione del NADP
Allo scopo di migliorare ancora la resa ottimale teorica dei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione, si possono prendere in considerazione delle modifiche supplementari, come la sovraespressione di almeno un gene scelto tra zwf, gnd, pntA, pntB e icd e/o la delezione di almeno un gene scelto tra edd, aceA, aceB e aceK.
b) bioconversione con S. cerevisiae
Le modellizzazioni predittive vengono realizzate utilizzando l'algoritmo MetOpt®-Scere, un modello stechiometrico sviluppato dalla società che permette di definire 1) la resa massima di produzione di etil-3-idrossibutirrato a partire da acetoacetato d'etile, 2) la migliore distribuzione del flusso a partire dal glucosio allo scopo di assicurare i bisogni di crescita e di equilibri ossidoriduttivi necessari per lo sviluppo della cellula e per il raggiungimento della resa massima di bioconversione.
I parametri imposti al modello sono per la precisione 1) un flusso di importazione di glucosio pari a 3 mmol.g-1.h-1, 2) un tasso di crescita variabile di 0, 0,15 e 0,25 h-1, 3) un flusso di mantenimento inferiore o uguale a 22 mmol.g-1.h-1; 4) le reazioni delle aldeidi deidrogenasi (ALD2, ALD3, ALD6) sono irreversibili e sono imposte nel senso acetato NAD(P)H → acetaldeide NAD(P); 5) il lievito non è provvisto di attività equivalenti a quelle di udhA o pntA,B.
Il modello permette di tener conto della compartimentalizzazione mitocondriale e perossisomale.
In tutti i casi, il modello suggerisce la delezione di un gene codificante per un enzima che ossida il NADPH e in particolare del gene ZTA1. In pratica, tuttavia, il ceppo S. cerevisiae [ΔZTA1] non permetterà di ottenere una resa equivalente alla resa ottimale teorica per il fatto che sarà difficile mantenere la distribuzione adeguata del flusso di carbonio tra la via dei pentoso-fosfati e quella della glicolisi, questa distribuzione essendo variabile in funzione del tasso di crescita. Nella pratica, si preferirà dunque utilizzare i ceppi S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2)] o [Δ(ZTA1, PGI1)], la scelta tra questi due ceppi essendo funzione del tasso di crescita del ceppo nel corso del procedimento di bioconversione.
Le rese ottimali teoriche di bioconversione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato sono state calcolate per diversi ceppi di S. cerevisiae ottimizzati secondo la presente invenzione:
µ = 0 µ=0,15h-1 µ=0,25 h-1
Δ(ZTA1,PGI1) 2,42 2,00 1,73
Δ(ZTA1,PGI1) TDH1,2,3-NADP dipendente 4,22 3,50 3,03
Δ(ZTA1,PGI1) LPD1-NADP dipendente 4,08 3,29 2,77
Δ(ZTA1,PGI1) TDH1,2,3-NADP dipendente LPD1-NADP dipendente 6,17 5,01 4,23
Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) 12,00 8,18 5,64
Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) TDH1,2,3-NADP-dipendente 12,00 9,11 7,19
Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) LPD1-NADP dipendente 12,00 8,44 6,06
Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) TDH1,2,3-NADP dipendente LPD1-NADP dipendente 12,00 9,28 7,46
Rese ottimali teoriche di bioconversione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato (moli per mole di glucosio) mediante ceppi di S. cerevisiae ottimizzati per quanto riguarda la loro capacità di riduzione del NADP
Allo scopo di migliorare ancora la resa ottimale teorica dei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione, si possono prendere in considerazione delle modifiche supplementari, come la sovraespressione di almeno un gene scelto ZWF, SOL1, SOL2, SOL3, SOL4, GND1, GND2, IDP1, IDP2 e IDP3 e/o la delezione di almeno un gene scelto ICL1, DAL7.
Esempio 2: Costruzione del ceppo E. coli [Δ(udhA, qor)]
L'inattivazione del gene udhA viene realizzata per ricombinazione omologa secondo la tecnica descritta da Datsenko e Wanner (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2000, 97: 6640-6645).
Questa tecnica consiste nell'inserire una cassetta di resistenza a un antibiotico (cloramfenicolo) deletando nello stesso tempo la maggior parte del gene interessato. A questo scopo, viene sintetizzata una coppia di oligonucleotidi costituiti ciascuno da 100pb (paia di basi) di cui 80pb (minuscole) sono omologhe al gene da deletare (per esempio udhA) e 20pb (maiuscole) sono omologhe alla cassetta di resistenza al cloramfenicolo:
DudhAF
DudhAR
La cassetta antibiotica portata dal plasmide pKD3 viene amplificata mediante la PCR utilizzando gli oligonucleotidi DudhAF e DudhAR. Il prodotto della PCR ottenuto viene a questo punto introdotto per elettroporazione nel ceppo E. coli [pKD46], che porta il gene codificante la Red ricombinasi, enzima che catalizza la ricombinazione omologa. I trasformanti resistenti al cloramfenicolo vengono a questo punto selezionati e l'inserimento della cassetta di resistenza viene verificato mediante un'analisi per PCR utilizzando gli oligonucleotidi UdhAF e UdhAR:
UdhaF
UdhaR
La cassetta di resistenza al cloramfenicolo viene successivamente eliminata. A questo scopo, il plasmide pCP20 che porta la ricombinasi FLP che agisce a livello dei siti FRT della cassetta di resistenza al cloramfenicolo, viene introdotto nei ceppi ricombinanti per elettroporazione. Poi, dopo una serie di coltivazioni a 42°C, la perdita della cassetta di resistenza all'antibiotico viene verificata mediante un'analisi per PCR con gli oligonucleotidi UdhAF e UdhAR.
L'inattivazione del gene qor viene realizzata secondo la stessa tecnica utilizzando i seguenti oligonucleotidi:
DqorF
DqorR
Per ragioni pratiche, può essere interessante deletare i due geni simultaneamente. A questo scopo, ogni gene viene sostituito mediante una cassetta di resistenza a un antibiotico differente (per esempio cloramfenicolo per udhA e kanamicina per qor).
Il ceppo ottenuto è dunque E. coli [Δ(udhA, qor)].
Esempio 3: Costruzione del plasmide pSK-PgapA-GRE2p, introduzione nel ceppo E. coli [Δ(udhA, qor)] e biotrasformazione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
Il plasmide pSK-PgapA viene costruito mediante inserimento del promotore gapA nel vettore pBluescript-SK (pSK). A questo scopo, il promotore gapA di E. coli viene amplificato con la polimerasi Pwo a partire dal DNA cromosomico.
Il prodotto della PCR ottenuto viene successivamente digerito mediante l'enzima di restrizione HindIIGli e viene ligato al vettore pSK digerito mediante l'enzima di restrizione HindIIGli e defosforilato allo scopo di fornire il plasmide pSK-PgapA. Il vettore pSK porta una origine di replicazione per E. coli e un gene di resistenza all'ampicillina.
Il plasmide pSK-PgapA viene a questo punto introdotto nel ceppo E. coli DH5α per una verifica della costruzione. La determinazione della sequenza del promotore gapA del plasmide pSK-PgapA con l'oligonucleotide universale M13 forward viene successivamente realizzata allo scopo di confermare la costruzione.
Il plasmide pSK-PgapA-GRE2p viene costruito mediante inserimento del gene GRE2p nel plasmide pSK-PgapA. A questo scopo, il gene GRE2p di Saccharomyces cerevisiae viene amplificato con la polimerasi Pwo a partire dal DNA cromosomico utilizzando i seguenti oligonucleotidi:
Ome 119_GRE2F (NdeI)
Ome120_GRE2R (PstI)
Il prodotto della PCR ottenuto viene successivamente digerito mediante gli enzimi di restrizione NdeI - PstGli e viene ligato al vettore pSK-PgapA digerito mediante gli enzimi di restrizione NdeI - PstGli e viene defosforilato a fornire il plasmide pSK-PgapA-GRE2p. Il plasmide pSK-PgapA porta una origine di replicazione per E. coli e un gene di resistenza all'ampicillina.
Il plasmide pSK-PgapA-GRE2p viene a questo punto introdotto nel ceppo E. coli DH5α allo scopo di verificare la costruzione. La determinazione della sequenza del gene GRE2p del plasmide pSK-PgapA-GRE2p con gli oligonucleotidi universali M13 reverse e M13 forward viene successivamente realizzata allo scopo di confermare la costruzione.
Il plasmide validato viene a questo punto introdotto nel ceppo E. coli [Δ(udhA, qor)] (esempio 2) per elettroporazione.
Il ceppo ottenuto E. coli [Δ(udhA, qor) pSK-PgapA-GRE2p] viene a questo punto coltivato in terreno minimo contenente glucosio e acetoacetato d'etile. Un ceppo di E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] viene coltivato nelle stesse condizioni.
Quando le colture sono ultimate, si confrontano:
- l'evoluzione della biomassa di ogni ceppo durante la fase di bioconversione,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato prodotto nell'ambiente extracellulare,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato accumulato nelle cellule,
- la produttività in etil-3-idrossibutirrato,
- la resa glucosio/etil-3-idrossibutirrato.
Si potrà osservare che il ceppo E. coli [Δ(udhA, qor) pSK-PgapA-GRE2p] presenta una resa di produzione di etil-3-idrossibutirrato aumentata rispetto al ceppo non ottimizzato.
Esempio 4: Costruzione del ceppo E. coli [Δ(udhA,qor,pgi) pSK-PgapA-GRE2p] e biotrasformazione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
L'inattivazione del gene pgi viene condotta nel ceppo E. coli [Δ(udhA, qor)] (esempio 2) utilizzando la tecnica descritta nell'esempio 2 e i seguenti oligonucleotidi:
DpgiF
DpgiR
pgiF
pgiR
La costruzione viene realizzata in ambiente ricco (per esempio LB). Si introduce allora, nel ceppo ottenuto, il plasmide pSK-PgapA-GRE2p (esempio 3) per elettroporazione, e il ceppo risultante, E. coli [Δ(udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p], viene selezionato su terreno ricco.
Il ceppo ottenuto a questo punto viene coltivato in terreno minimo contenente glucosio e acetoacetato d'etile. Un ceppo di E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] viene coltivato nelle stesse condizioni.
Quando le colture sono ultimate, si confrontano:
- l'evoluzione della biomassa di ogni ceppo durante la fase di bioconversione,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato prodotto nell'ambiente extracellulare,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato accumulato nelle cellule,
- la produttività in etil-3-idrossibutirrato,
- la resa glucosio/etil-3-idrossibutirrato.
Si potrà osservare che il ceppo E. coli [Δ(udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p] presenta una resa di produzione di etil-3-idrossibutirrato aumentata rispetto al ceppo non ottimizzato.
molEHB/molGlucosio
MG1655 pSK-PgapA-GRE2p 0,75
MG1655 Δ(udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p 2,12
Esempio 5: Costruzione del ceppo E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] e biotrasformazione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
L'inattivazione del gene edd viene condotta nel ceppo E. coli [Δ(udhA, qor, pgi)] (esempio 4) utilizzando la tecnica descritta nell'esempio 2, e i seguenti oligonucleotidi:
DeddF (1932582-1932499)
DeddR (1930866-1930943)
EddF (1932996-1932968)
EddR (1930439-1930462)
La costruzione viene realizzata in terreno ricco (per esempio LB). Si introduce allora, nel ceppo ottenuto E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd)], il plasmide pSK-PgapA-GRE2p (esempio 3) per elettroporazione, e il ceppo risultante E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] viene selezionato su terreno ricco.
Il ceppo ottenuto E. coli [A(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] viene allora coltivato in terreno minimo contenente glucosio e acetoacetato d'etile. Un ceppo di E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] viene coltivato nelle stesse condizioni.
Quando le colture sono ultimate, si confrontano:
- l'evoluzione della biomassa di ogni ceppo durante la fase di bioconversione,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato prodotto nell'ambiente extracellulare,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato accumulato nelle cellule,
- la produttività in etil-3-idrossibutirrato,
- la resa glucosio/etil-3-idrossibutirrato.
Si potrà osservare che il ceppo E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd) pSK-PgapA-GRE2p] presenta una resa di produzione di etil-3-idrossibutirrato aumentata rispetto al ceppo non ottimizzato.
Esempio 6: Costruzione del ceppo E. coli [Δ(udhA, gor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] e biotrasformazione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
L'inattivazione del gene pfkA e pfkB viene condotta nel ceppo E. coli [Δ(udhA, qor)] (esempio 2) utilizzando la tecnica descritta nell'esempio 2, e i seguenti oligonucleotidi:
DpfkAF
DpfkAR
PtkAF
PfkAR
DpfkBF (1804421-1804499)
DpfkBR (1805320-1805241)
PfkBF (1803996-1804025)
PfkBR (1805657-1805632)
La costruzione viene realizzata in terreno ricco (per esempio LB). Si introduce allora, nel ceppo ottenuto E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB)], il plasmide pSK-PgapA-GRE2p (esempio 3) per elettroporazione, e il ceppo risultante E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] viene selezionato su terreno ricco.
Il ceppo ottenuto E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] viene allora coltivato in terreno minimo contenente glucosio e acetoacetato d'etile. Un ceppo E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] viene coltivato nelle stesse condizioni.
Quando le colture sono ultimate, si confrontano:
- l'evoluzione della biomassa di ogni ceppo durante la fase di bioconversione,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato prodotto nell'ambiente extracellulare,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato accumulato nelle cellule,
- la produttività in etil-3-idrossibutirrato,
- la resa glucosio/etil-3-idrossibutirrato.
Si potrà osservare che il ceppo E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] presenta una resa di produzione di etil-3-idrossibutirrato aumentata rispetto al ceppo non ottimizzato.
molEHB/ molGlucosio
MG1655 pSK-PgapA-GRE2p 0,75
MG1655 Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p 3,46
Esempio 7: Costruzione del ceppo E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd) plpd*, pSK-PgapA-GRE2p] e biotrasformazione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
Il gene lpd che codifica la diidrolipoammide deidrogenasi NAD-dipendente, implicata nel complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi, viene deletato utilizzando la tecnica descritta nell'esempio 2, salvo il fatto che il ceppo iniziale è il ceppo E. coli [Δ(udhA, qor, pgi)] descritto nell'esempio 4 invece di essere un ceppo selvatico. La costruzione e la selezione del ceppo modificato vengono realizzate in terreno ricco (per esempio LB). Il ceppo ottenuto è E.coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)].
D'altra parte, si costruisce il plasmide p-lpd* che permette la sovraespressione di una diidrolipoammide deidrogenasi NADP-dipendente. Esistono differenti possibilità per modificare la specificità di cofattore di un enzima. Per esempio, Bocanegra et al. (1993) divulgano un metodo che serve a creare una diidrolipoammide deidrogenasi NADP-dipendente.
I plasmidi p-lpd* e pSK-PgapA-GRE2p vengono allora introdotti per elettroporazione nel ceppo E.coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)], alternativamente è possibile scegliere di clonare lpd* su pSK-PgapA-GRE2p; si ottiene allora il plasmide pSK-PgapA-GRE2p-lpd* che viene introdotto per elettroporazione nel ceppo E.coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)]. La costruzione e la selezione del ceppo modificato vengono realizzate in terreno ricco (per esempio LB).
Il ceppo ottenuto E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd) pSK-PgapA-GRE2p, p-lpd*)] viene allora coltivato in terreno minimo contenente glucosio e acetoacetato d'etile. Un ceppo E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] viene coltivato nelle stesse condizioni.
Quando le colture sono ultimate, si confrontano:
- l'evoluzione della biomassa di ogni ceppo durante la fase di bioconversione,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato prodotto nell'ambiente extracellulare,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato accumulato nelle cellule,
- la produttività in etil-3-idrossibutirrato,
- la resa glucosio/etil-3-idrossibutirrato.
Si potrà osservare che il ceppo E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd) pSK-PgapA-GRE2p, p-lpd*)] presenta una resa di produzione di etil-3-idrossibutirrato aumentata rispetto al ceppo non ottimizzato.
Esempio 8: Costruzione del plasmide pRSGK-GRE2p
Il plasmide pYGK viene costruito per inserimento del promotore Ppgk, del sito di multiclonazione e del terminatore cyc1 del vettore pYPG2, nel vettore pBluescript-SK (pSK). A questo scopo, il promotore Ppgk, il sito di multiclonazione e il terminatore cyc1 vengono amplificati con la polimerasi Pfu Turbo a partire dal vettore pYPG2. Il prodotto della PCR ottenuto viene successivamente digerito mediante gli enzimi di restrizione SacII - NotGli e viene ligato al vettore pSK digerito mediante gli enzimi di restrizione ApaI - SmaI, ligato e poi digerito mediante gli enzimi di restrizione NotI - SacIGli e defosforilato allo scopo di fornire il plasmide pYGK.
Il plasmide pYGK viene a questo punto introdotto nel ceppo E. coli DH5α per la verifica della costruzione. La determinazione della sequenza del promotore Ppgk, del sito di multiclonazione e del terminatore cyc1 del plasmide pYGK con gli oligonucleotidi universali M13 reverse e M13 forward viene successivamente realizzato allo scopo di confermare la costruzione.
Il plasmide pYGK-GRE2p viene successivamente costruito per inserzione del gene GRE2p nel plasmide pYGK. A questo scopo, il gene GRE2p di Saccharomyces cerevisiae viene amplificato con la polimerasi Pwo a partire dal DNA cromosomico, utilizzando i seguenti oligonucleotidi:
Ome376_Gre2 pYGK F (SmaI)
Ome377_Gre2 pYGK R (ApaI)
Il prodotto della PCR ottenuto viene successivamente digerito mediante gli enzimi di restrizione ApaI - SmaGli e viene ligato al vettore pYGK digerito mediante gli enzimi di restrizione ApaI - SmaGli e defosforilato allo scopo di fornire il plasmide pYGK-GRE2p.
Il plasmide pYGK-GRE2p viene a questo punto introdotto nel ceppo E. coli DH5α per la verifica della costruzione. La determinazione della sequenza del gene GRE2p del plasmide pYGK-GRE2p con gli oligonucleotidi universali M13 reverse e M13 forward viene successivamente realizzata allo scopo di confermare la costruzione.
Il plasmide pRSGK-GRE2p viene alla fine ottenuto per digestione dei plasmidi pYGK-GRE2p e pRS426 con gli enzimi di restrizione NotI - SacII seguita da ligazione.
Esempio 9: Costruzione del ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] e biotrasformazione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
L'inattivazione del gene ZTA1 viene realizzata inserendo un marcante (resistenza ad un antibiotico, auxotrofia) deletando nello stesso tempo la maggior parte del gene interessato. La tecnica utilizzata è descritta da Brachmann et al. (Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications, Yeast, 1998, 14: 115-32). E' possibile anche utilizzare la tecnica descritta da Wach et al. (New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 1994, 10: 1793-1808).
In tutti i casi, viene ottenuto un ceppo finale di S. cerevisiae [Δ(ZTA1)], nel quale è allora introdotto il plasmide pRSGK-GRE2p (esempio 8).
Alternativamente, è anche possibile scegliere di introdurre il plasmide pRSGK-GRE2p in un ceppo Δ(ZTA1) disponible, per esempio il ceppo EUROSCARF Y33183 (genotipo: BY4743; Mat a/α; his3D1/his3D1; leu2D0/leu2D0; lys2D0/LYS2; MET15/met15D0; ura3D0/ura3D0; YBR046c::kanMX4/YBR046c::kanMX4). E' allora possibile, dopo sporulazione, recuperare un ceppo omozigota: S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p].
Il ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] ottenuto viene successivamente coltivato in terreno minimo contenente glucosio e acetoacetato d'etile.
Il ceppo testimone S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] viene coltivato nelle stesse condizioni.
Quando le colture sono ultimate, si confrontano:
- l'evoluzione della biomassa di ogni ceppo durante la fase di bioconversione,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato prodotto nell'ambiente extracellulare,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato accumulato nelle cellule,
- la produttività in etil-3-idrossibutirrato,
- la resa glucosio/etil-3-idrossibutirrato.
Si potrà osservare che il ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] presenta una resa di produzione di etil-3-idrossibutirrato aumentata rispetto al ceppo non ottimizzato.
Esempio 10: Costruzione del ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] e biotrasformazione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
L'inattivazione del gene PGI1 viene condotta nel ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] utilizzando la tecnica descritta nell'esempio 9, e i seguenti oligonucleotidi:
Dpgi1F
DpgilR
PgilF
Pgi1R
Alternativamente, è possibile utilizzare un ceppo A(PGI1) disponible, per esempio il ceppo EUROSCARF Y23336 (Mat α/a; his 3D1/his3D1; leu2D0/leu2D0; lys2D0/LYS2; MET15/met15D0; ura3D0/ura3D0; YBR196c::kanMX4/YBR196c). Il ceppo viene allora trasformato mediante il plasmide pRSGK-GRE2p (esempio 8), e poi la delezione del gene ZTA1 viene realizzata utilizzando la tecnica descritta nell'esempio 9.
Il ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] ottenuto viene successivamente coltivato in terreno minimo contenente glucosio e acetoacetato d'etile.
Il ceppo testimone S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] viene coltivato nelle stesse condizioni.
Quando le colture sono ultimate, si confrontano:
- l'evoluzione della biomassa di ogni ceppo durante la fase di bioconversione,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato prodotto nell'ambiente extracellulare,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato accumulato nelle cellule,
- la produttività in etil-3-idrossibutirrato,
- la resa glucosio/etil-3-idrossibutirrato.
Si potrà osservare che il ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] presenta una resa di produzione di etil-3-idrossibutirrato aumentata rispetto al ceppo non ottimizzato.
Esempio 11: Costruzione del ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] e biotrasformazione dell'acetoacetato d'etile in etil-3-idrossibutirrato
I geni PFK1 e PFK2 vengono deletati nel ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1)] utilizzando la tecnica descritta nell'esempio 9, e i seguenti oligonucleotidi:
Dpfk1F
Dpfk1R
Pfk1 int F
Pfk1 int R
Pfk2 int F
Pfk2 int R
GATCAGCACCAGTCAAAGAACC
Il ceppo a questo punto viene trasformato mediante il plasmide pRSGK-GRE2p (esempio 8).
Il ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] ottenuto viene successivamente coltivato in terreno minimo contenente glucosio e acetoacetato d'etile.
Il ceppo testimone S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] viene coltivato nelle stesse condizioni.
Quando le colture sono ultimate, si confrontano:
- l'evoluzione della biomassa di ogni ceppo durante la fase di bioconversione,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato prodotto nell'ambiente extracellulare,
- la quantità di etil-3-idrossibutirrato accumulato nelle cellule,
- la produttività in etil-3-idrossibutirrato,
- la resa glucosio/etil-3-idrossibutirrato.
Si potrà osservare che il ceppo S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] presenta una resa di produzione di etil-3-idrossibutirrato aumentata rispetto al ceppo non ottimizzato.
molEHB/ molGlucosio
S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] in corso
S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] in corso
Esempio 12: Confronto tra i valori sperimentali e quelli previsti mediante il modello metabolico per l'ottimizzazione della produzione di etil-3-idrossibutirrato mediante Escherichia coli
Si potrà osservare una buona correlazione tra le modellizzazioni di previsione (esempio 1) e le realizzazioni sperimentali descritte negli esempi 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 e 11.
Gli esempi da 1 a 11 presentati qui sopra sono delle applicazioni particolari del brevetto e non ne limitano l'utilizzo. Il tecnico del ramo saprà adattare con facilità questi esempi per la biotrasformazione di molecole aventi una sintesi NADPH-dipendente. L'algoritmo MetOpt® e la strategia di ottimizzazione di un procedimento di bioconversione NADPH-dipendente attraverso l'ottimizzazione del rapporto NADPH/NADP sono validati; questo ci permette inoltre di rivendicare un'applicazione ampliata a tutte le biotrasformazioni NADPH-dipendenti che potranno venire modellizzate e previste mediante MetOpt® o mediante uno dei suoi derivati, utilizzando E. coli, S. cerevisiae o qualsiasi altro microorganismo.
Esempio 13: Calcolo delle rese ottimali teoriche nel quadro dei procedimenti di fermentazione in E. coli
L'esempio 12 mostra che i modelli MetOpt® sviluppati dalla società sono applicabili alle bioconversioni e dovrebbero applicarsi in maniera più generale alle biotrasformazioni come le fermentazioni.
Per fornire alcuni esempi, il modello MetOpt®-Coli viene applicato alla produzione di cisteina o di 3-idrossipropionato per fermentazione del glucosio nei ceppi di E. coli ottimizzati secondo la presente invenzione. I parametri utilizzati sono gli stessi utilizzati nell'esempio 1. Per la precisione: 1) un flusso di importazione di glucosio pari a 3 mmol.g-1.h-1, 2) un tasso di crescita variabile di 0, 0,15 e 0,25 h-1, 3) un flusso della transidrogenasi di membrana (pntAB) variabile e inferiore o uguale a 1 mmol.g-1.h-1. Il valore del flusso della transidrogenasi di membrana viene determinato a partire dalla letteratura (Hanson, 1979; Anderlund et al., 1999; Emmerling et al., 2002); 4) il flusso di mantenimento è stato limitato tra 5 e 22 mmol.g-1.h-1.
a) Caso della produzione di cisteina per fermentazione del glucosio
µ=0 µ=0,15h-1 µ=0,25h-1
Δ(udhA, qor, pgi) 0,66 0,37 0,09
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dipendente 0,78 0,37 0,09
Δ(udhA, qor, pgi) lpd-NADP dipendente 0,78 0,37 0,09
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dipendente lpd-NADP dipendente 0,78 0,37 0,09
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) 0,40 0,18 0,01
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dipendente 0,62 0,30 0,06
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) Ipd-NADP dipendente 0,71 0,36 0,13
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dipendente lpd-NADP dipendente 0,77 0,42 0,17
Rese ottimali teoriche di produzione della cisteina da parte di ceppi di E. coli ottimizzati per quanto riguarda la loro capacità di riduzione del NADP (moli per mole di glucosio)
Allo scopo di migliorare ancora la resa ottimale teorica dei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione, si possono prendere in considerazione delle modifiche supplementari, come la sovraespressione di almeno un gene scelto tra zwf, gnd, pntA, pntB e icd e/o la delezione di almeno un gene scelto tra edd, aceA, aceB e aceK.
Nella pratica, allo scopo di ottenere rese di questo genere, dovranno venire apportate altre modifiche ai ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione, per esempio mediante il fatto di sovraesprimere il gene cysB come è descritto nel brevetto WO0127307, oppure modificando il gene cysE come è descritto nel brevetto europeo EP0885962.
b) caso della produzione di 3-idrossipropionato per fermentazione del glucosio
La produzione di 3-idrossipropionato viene realizzata in ceppi di E. coli contenenti i geni codificanti per gli enzimi della via di sintesi del 3-idrossipropionato, per esempio la malonil-coA reduttasi di Chloroflexus aurantiacus (Hügler et al., Journal of Bacteriology, 2002, 184: 2404-2410).
µ=0 µ=0,15h-1 µ = 0,25 h-1
Δ(udhA, qor, pgi) 1,33 0,79 0,30
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dipendente 1,76 0,99 0,30
Δ(udhA, qor, pgi) lpd-NADP dipendente 1,82 0,99 0,30
Δ(udhA, qor, pgi) gapA-NADP dipendente lpd-NADP dipendente 1,82 0,99 0,30
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) 1,62 0,66 0,03
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dipendente 1,76 0,79 0,07
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) Ipd-NADP dipendente 1,79 0,84 0,07
Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dipendente lpd-NADP dipendente 1,79 0,84 0,07
Rese ottimali teoriche di produzione di 3-idrossipropionato da parte di ceppi di E. coli ottimizzati per quanto riguarda la loro capacità di riduzione del NADP (moli per mole di glucosio)
Allo scopo di migliorare ancora la resa ottimale teorica dei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione, si possono prendere in considerazione delle modifiche supplementari, come la sovraespressione di almeno un gene scelto tra zwf, gnd, pntA, pntB e icd e/o la delezione di almeno un gene scelto tra edd, aceA, aceB e aceK.
Esempio 14: Calcolo delle rese ottimali teoriche nel quadro dei procedimenti di fermentazione in S. cerevisiae; applicazione alla produzione di idrocortisone
L'esempio 12 mostra che i modelli MetOpt® sviluppati dalla società sono applicabili alle bioconversioni e dovrebbero applicarsi in maniera più generale alle biotrasformazioni come le fermentazioni.
Per fornire alcuni esempi, il modello MetOpt®-Scere viene applicato alla produzione di idrocortisone per fermentazione del glucosio in ceppi di S. cerevisiae ottimizzati secondo la presente invenzione. I parametri utilizzati sono gli stessi utilizzati nell'esempio 1, per la precisione: 1) un flusso di importazione di glucosio pari a 3 mmol.g-1.h-1, 2) un tasso di crescita variabile di 0, 0,15 e 0,25 h-1, 3) un flusso di mantenimento inferiore o uguale a 22 mmol.g-1.h-1; 4) le reazioni delle aldeide deidrogenasi (ALD2, ALD3, ALD6) sono irreversibili e sono imposte nel senso acetato NAD(P)H → acetaldeide NAD(P); 5) il lievito non è provvisto di attività equivalenti a quelle di udhA o pntA,B.
Il modello permette di tener conto della compartimentalizzazione mitocondriale e perossisomiale.
Questa rappresentazione dei risultati permette di mettere in evidenza l'apporto reale di ciascuna delle mutazioni apportate secondo la presente invenzione nel miglioramento della produzione di NADPH e dunque nel miglioramento del flusso di produzione di idrocortisone.
La produzione di idrocortisone viene realizzata in ceppi di S. cerevisiae contenenti i geni codificanti per gli enzimi della via di sintesi dell'idrocortisone (Szczebara et al., 2003, Nature Biotechnology, 21: 143-149).
µ = 0 µ=0,15h-1 µ=0,25h-1
Δ(ZTA1,PGI1) 0,12 0,08 0,06
Δ(ZTA1, PGI1) TDH1,2,3-NADP dipendente 0,21 0,14 0,10
Δ(ZTA1, PGI1) LPD1-NADP dipendente 0,20 0,14 0,10
A(ZTA1, PGI1) TDH1,2,3-NADP dipendente LPD1-NADP dipendente 0,21 0,14 0,10
Rese ottimali teoriche di produzione di idrocortisone da parte di ceppi di S. cerevisiae ottimizzati per quanto riguarda la loro capacità di riduzione del NADP (moli per mole di glucosio)
I ceppi nei quali i geni PFK1 e PFK2 sono stati deletati non sono capaci di produrre idrocortisone, o addirittura non sono vitali. Questo è dovuto al fatto che la produzione di idrocortisone è maggiormente limitata dalla richiesta di carbonio piuttosto che dal bisogno di NADPH. Una soluzione consiste nel permettere una leggera espressione di una attività di tipo transidrogenasi nel lievito. Tuttavia, le modellizzazioni mostrano che il flusso di produzione di idrocortisone non sarà mai altrettanto buono quanto nel caso di una delezione del gene PGI1.
Allo scopo di migliorare ancora la resa ottimale teorica dei ceppi ottimizzati secondo la presente invenzione, si possono prendere in considerazione delle modifiche supplementari, come la sovraespressione di almeno un gene scelto tra ZWF, SOL1, SOL2, SOL3, SOL4, GND1, GND2, IDP1, IDP2 e IDP3 e/o la delezione di almeno un gene scelto tra ICL1, DAL7.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
- Anderson, E.H. (1946) Growth requirements of virus-resistant mutants of Escherichia coli strain "B", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128
- Baudin, A.; Ozier-Kalogeropoulos, O.; Denouel, A.; Lacroute,F. and Cullin, C. (1993) A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae,., Nucl. Acids Res. 21, 3329-3330
- Bocanegra, J.A. Scrutton, N.S.; Perham, R.N. (1993) Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering. Biochemis | English to Italian: ALDOL CONDENSATION REACTION AND CATALYST THEREFORE
General field: Law/Patents
Detailed field: Chemistry; Chem Sci/Eng | Source text - English
[0001] The invention relates to a novel processes for cross aldol reactions using strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin with a -CH2N (CH3)3 active group as heterogeneous catalysts. This catalyst is recyclable and the process can be repeated several times.
[0002] Aldol reactions are important in the production of intermediates needed to synthesize many commercially important products. The addition of ketones and/ or aldehydes to obtain aldols (β-hydroxy ketones) is a well-known reaction. Dehydration of the resulting aldol to obtain an α,β-unsaturated ketone is also known. Subsequent catalytic hydrogenation of the unsaturated ketone may be carried out to obtain the corresponding saturated higher ketone. However, the starting materials, the intermediate β-hydroxy ketones as well as the α,β-unsaturated ketones are known to those skilled in the art to be quite reactive and susceptible to further consecutive, non-selective condensation, cyclization, and Michael-type addition reactions with the starting ketones and aldehydes as well as themselves and other ketones and aldehyde by-products.
[0003] Many methods have been disclosed in the art to perform aldol condensation reactions. These methods include for example homogeneous, base catalyzed aldol reactions such as disclosed in WO 2004041764 or CN 1202065. However, homogeneous catalyzed aldol reactions have the disadvantage of exhibiting high salt content often resulting in an unwanted contamination of the final product. Heterogeneous catalyzed reactions are also disclosed as versatile methods to catalyze aldol reactions. Heterogeneous catalysis is of fundamental importance in the chemical industry because of its "simplicity" as the catalyst can be removed via filtration.
[0004] Various anion exchange resins are described to catalyze aldol condensation reactions for example strong basic polystyrene anion exchange resins for the condensation of citral and acetone [Z. Nengfang; L., Guiyun. Lizi Jiaohuan Yu Xifu: (1991), 7(2), 142-146, L. Tianhua et al: Jiangsu Shiyou Huagong Xueyuan Xuebao (1998), 10(1), 15-18] or a fluoride ion supported on anion exchange resin [Lin, Hong-wei. Hecheng Huaxue (2004), 12(4), 402-404]. However, no detailed information about the properties of the catalyst is given.
[0005] PL 147748 discloses the preparation of ionones and methylionones by condensation of citral with acetone or methyl ethyl ketone (2-butanone) using weak basic anion exchanger catalysts. However, the catalyst has a gel structure and can not versatile be recycled.
[0006] Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa (1997), 9(3), 59-64 discloses the use of macroporous strong-base ion exchange resin for the preparation of pseudoionone. However, the needed amount of ion exchanger is large and the lifetime is short, so the process is not economical.
[0007] Thus, there is an ongoing need for a simple, economically attractive, highly selective and environmentally benign method which allows the aldol condensation products to be formed in good yields and purities and, permits the catalyst to be recycled by means of a simple industrial process and makes it possible to guarantee constantly stable yields and process conditions with repeated use of the catalyst.
[0008] As a result of extensive screening studies, it has surprisingly been found that the object of the invention is achieved by using a strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin having quaternary ammonium groups as active sites as catalyst for carrying out the aldol condensation reaction, especially a catalyst with a surface area of 10-100 m2/g, preferably 20-50 m2/g, in particular with a surface area 30 m2/g, and an average pore diameter of 200-500A, in particular 290 - 300 Å.
[0009] Thus, the invention relates to a process for the preparation of α,β-unsaturated ketones, the process comprising the step of reacting an aldehyde of formula (1)
with a ketone of formula (2)
wherein R1, R2 and R3 represent independently of each other hydrogen, a saturated or unsaturated, branched or non-branched, hydrocarbons residue with 1 to 20 C-atoms or a cycloalkyl group with 4 to 12 C-atoms, which optionally may be substituted e.g. by one or several methoxy groups in the presence of a strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin having
a)quaternary ammonium groups of the type -CH2N (CH3)3 as active sites
b) a surface area of 10 - 100 m2/g, preferably of 20 - 50 m2/g, in particular a surface area of 30 m2/g, and
c) an average pore diameter of 200-500 Å, in particular 290 - 300 Å.
[0010] In the following the strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin according to the invention is abbreviated as "solid catalyst".
[0011] Surprisingly, it has been found that in case of citral using asymmetric methylketones a high selectivity towards the addition to the methyl group can be achieved. Thus, in a preferred embodiment the invention relates to a process for the preparation of α,β-unsaturated ketones as outlined above wherein the aldehyde is citral, R3 is methyl and R2 is selected from a saturated or unsaturated, branched or non-branched, hydrocarbons residue with 1 to 20 C-atoms or a cycloalkyl group with 4 to 12 C-atoms, which optionally may be substituted e.g. by one or several methoxy groups.
[0012] The following scheme illustrates the aldol condensation reaction according to the invention whereby the compound in bracket is passed through as intermediate.
[0013] The addition of the ketone to the aldehydes results in an intermediate aldol (β-hydroxy ketones) which is dehydrated in situ to the respective α,β-unsaturated ketone. This reaction is catalyzed by the solid catalyst according to the invention.
[0014] In another preferred embodiment, the invention relates to a process for the production of α,β-unsaturated ketones of formula (3)
the process comprising reacting an alkyl ketone of formula (4)
and an aldehyde of formula (5)
wherein
R4 represents a saturated or unsaturated, linear or branched hydrocarbons residue with 1 to 20 C-atoms, preferably a saturated or unsaturated hydrocarbons residue with 1 to 10 C-atoms, more preferably a saturated hydrocarbons with 1 to 5 C-atoms (i.e. 1,2,3,4, or 5 C-atoms), and
R5 represents hydrogen, a saturated or unsaturated, linear or branched hydrocarbons residue with 1 to 20 C-atoms or a cycloalkyl group with 4 to 12 C-atoms, which optionally may be substituted e.g. by one or several methoxy or ether groups, preferably hydrogen and n represents a number from 0 to 4, preferably from 0 to 2 and
wherein the dotted lines indicate, independently of each other, either a saturated or a double bond and if the dotted lines represent a double bond, it can be arranged in one of the two indicated positions and
wherein the process is carried out in the presence of a strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin having
a)quaternary ammonium groups of the type -CH2N (CH3)3 as active sites and
b) a surface area of 10 - 100 m2/g, preferably of 20 - 50 m2/g, in particular a surface area of 30 m2/g, and
c) an average pore diameter of 200-500 Å, in particular 290 - 300 Å.
[0015] Particular preferred is a process as outlined above wherein R4 is a linear, saturated hydrocarbon residue with 1 to 5 carbon atoms and n represents a number from 1 to 2 and the counter ion of the strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin is OH-. Most preferably the aldehyde is citral, R4 is a linear, saturated hydrocarbon residue with 1 to 5 carbon atoms and n represents a number from 1 to 2 and the counter ion of the strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin is OH-.
[0016] In all embodiments of the invention preferably the catalyst is recycled after termination of the reaction by filtration, optionally washed with an alcohol, preferably ethanol and re-used in a subsequent reaction cycle. Preferably, the process according to the invention including the recycling of the solid catalyst is repeated at least once using the recycled catalyst, even more preferably, the catalyst is re-used 2 to 10 times such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 times, in particular 4 times in the process according to the invention.
[0017] In all embodiments of the invention, the solid catalyst preferably is strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin based on a crosslinked styrene divinylbenzene copolymer containing -CH2N (CH3)3 groups as active sites.
[0018] The counter ion of the positively charged solid catalyst according to the invention can be selected from any negatively charged ion such as Cl-, Br- or OH-. In all embodiments of the invention the counter ion is preferably OH-. The concentration of the active sites is preferably >0.7 eq/L, most preferably ≥ 0.8 eq/L. The solid catalysts for the processes according to the invention can be prepared by known methods to a person skilled in the art or are e.g. obtainable from Rohm & Haas under the trade name Amberlyst 26 OH or Ambersep 900.
[0019] Suitable ketones for the process according to the invention include acetone, methyl ethyl ketone (2-butanone), diethyl ketone (3-pentanone), methyl propyl ketone (i.e. 2-pentanone), 3-methylbutyraldehyde (i.e. isovaleraldehyd), methyl n-butyl ketone (2-hexanone), methyl isobutyl ketone, methyl-tert.-butyl ketone without being limited thereto. Preferably, the ketone is selected from acetone, 2-pentanone or 2-butanone.
[0020] Exemplary aldehydes for the process include paraformaldehyde, 3-methylbutyraldehyde, 3-methyl crotonic aldehyde, heptanal, citral, 3,7-dimethyl-2-octenal or 3,7-dimethyl-1-octanal without being limited thereto. Preferred aldehydes according to the invention are paraformaldehyd, heptanal, 3-methylbutyraldehyd and citral.
[0021] In a further preferred embodiment the invention relates to a process according to the invention wherein the aldehyde of formula (5) is citral.
[0022] Furthermore, the process according to the invention is particularly suitable for carrying out the aldol condensation of citral (formula (5) n = 1) with acetone (formula (4) R4 = methyl, R5 = hydrogen) to give ψ-ionone (formula (3) R4 = methyl, R5 = hydrogen, n = 1) respectively of citral (formula (5) n = 1) with 2-pentanone (formula (4) R4 = propyl, R5 = hydrogen) to give 8,12-dimethyl-5,7,11-tridecatrien-4-one (formula (3) R4 = propyl, R5 = hydrogen, n = 1) as well as of 3-methylbutyraldehyde (formula (5) n = 0) with acetone to give 6-methyl-hept-3-ene-2-one (formula (3), R4 = methyl, R5 = hydrogen, n = 0) as depicted in the scheme below:
ψ -lonone, 8,12-dimethyl-5,7,11-tridecatrien-4-one as well as 6-methyl-hept-3-ene-2-one are important intermediates for vitamin and fragrance production e.g. for the production of timberone, geraniol, nerol, geranyl acetone, neryl acetone, linalool, dihydrolinalool, isonaline, vitamin E, vitamin A and β-carotene.
[0023] Thus, in a particular embodiment, the invention relates to a process according to the invention with all the preferences and definitions given herein wherein the alkylketone and the aldehyde are selected from
(i) citral and acetone and/ or
(ii) citral and 2-pentanone and/ or
(iii) citral and diethyl ketone and/ or
(iv) citral and 2-butanone and/ or
(v) 3-methylbutyraldehyde and acetone and/ or
(vi) 3-methylbutyraldehyde and 2-butanone and/ or
(vi) 3-methylbutyraldehyde and 2-pentanone and/ or
(vii) heptanal and 2-butanone and/ or
(viii) heptanal and acetone.
[0024] A particular advantage of the inventive process is the use of the solid catalyst which exhibits an exceptional stability and allows simple regeneration by filtration. Thus, the solid catalyst can be re-used while maintaining its activity. After filtration, the solid catalyst can be regenerated by methods known to a skilled person in the art. For example the solid catalyst can be regenerated by washing with a polar solvent such as methanol or ethanol followed by a treatment with aqueous NaOH (e.g. 1 M NaOH). After the basic treatment, the catalyst is washed with water until the eluate is neutral followed by washing with a polar solvent such as in particular ethanol. Afterwards the solid catalyst is ready for use in the process according to the invention.
[0025] The catalyst may be used as such or it may be suspended prior to its use. In a preferred embodiment of the invention the solid catalyst is suspended in a polar solvent such as methanol or ethanol, in particular ethanol. After termination of the reaction the catalyst can be recycled by simple technical measures such as filtration or decantation.
[0026] The amount of the solid catalyst used in the processes according to the invention is based on the amount of aldehyde. Usually the amount of the solid catalyst is selected in the in the range of 15 to 50 mol%, preferably from 20 to 40 mol%, in particular in the range of 25 to 35 mol%, most in particular 33 mol% based on the aldehyde, The mol% catalyst to be used is calculated on the basis of its active sites. Such amounts of the solid catalyst are sufficient to obtain high yields of desired product.
[0027] The process according to the invention can be carried out without an additional solvent or in the presence of an additional solvent. Suitable solvents for the aldol condensation reaction are polar protic solvents, e.g. methanol or ethanol. Preferably, the reaction is carried out using ethanol. In another preferred embodiment the reaction is carried out solvent-free.
[0028] The ratio of ketone to aldehyde is not critical for the reaction and can vary over a wide range, although the ketone is normally used as excess component in order to achieve high product selectivity in relation to the aldehyde. Good results are obtained if a molar ratio of the aldehyde to the ketone of 1:0.5 to 1: 50, preferably 1:1 to 1:30, most preferably in the range of 1:3 to 1:10, in particular in the range of 1:4 to 1:8, most in particular 1:8 is used. Advantageously, an excess of the ketone is used in the process according to the invention.
[0029] The reaction can be performed at various temperatures and pressures the optimum being defined by the starting materials used. Generally, the reaction temperatures may vary from - 20 to 100°C. Preferably, the reaction temperature is selected in the range of 20 to 60°C, in particular in the range of 40 to 60°C, in particular 60°C. The pressures may vary from 0.1 to 100 bar absolute. Preferably, the reaction is carried out at atmospheric pressure.
[0030] The process according to the invention can in principle be carried out in any reactor suitable for heterogeneously catalyzed reactions. Without restricting generality, the following are mentioned by way of example: suspension reactor, stirred.tank, stirred tank cascade, tubular reactor, shell-type reactor, shell and tube reactor, fixed-bed reactor, fluidized-bed reactor, reactive distillation column.
[0031] The invention is illustrated further by the examples without being limited thereto.
Example 1
[0032] Paraformaldehyde (63.3 mmol, 1 equiv.) acetone (26 equiv.) and 25 wt.% (based on paraformaldehyde) Amberlyst A 26 OH are mixed in a round bottom flask and the flask is put into an oil bath, preheated to 50 °C. The reaction mixture is stirred for 23.5h, filtered and analyzed, resulting in 10% yield of hydroxybutan-2-one.
[0033] The same reaction is repeated using 25 wt.-% (based on paraformaldehyde) Ambersep 900 OH resulting in a yield of 4-hydroxybutane-2-one of 13%.
[0034] The use of a weakly basic anion exchanger such as Amberlite IRA-96 resulted in no conversion at all.
Example 2
[0035] 3 g of Amberlyst A 26 OH is stirred for 15 min in 50 ethanol. The solvent is decanted. After the addition of 50 ml ethanol the reaction mixture is heated to 40 °C, respectively 60°C. Citral (0.65g, 11.1mmol) and a suitable amount of acetone in order to achieve the indicated molar ratios as shown in table 1 are added at once and the reaction mixture is stirred for 3 h at 40 °C/ 60°C. The reaction mixture is decanted and the ion exchanger washed twice with 25 ml ethanol. The combined organic phases are concentrated in vacuo at 40 °C and 30 mbar. The yield of pseudoionone is given in the table below. The catalyst is re-used for each run without further treatment.
Table 1
Run Acetone citral 1:1* Acetone citral 4:1* Acetone citral 8:1*
yield [%]
40°C yield [%]
60°C yield [%] 40°C yield [%]
60°C yield [%]
40°C yield [%]
60°C
1 23 50 54 62 66 68
2 18 38 53 60 65 67
3 13 32 46 60 62 69
4 6 17 32 62 49 77
5 10 39 36 43
* ratio based on the molar amount
[0036] The reaction outlined above using citral and acetone has been repeated using a weak basic anion exchange, i.e. Amberlite IRA-96. However no conversion at all could be achieved.
Example 3
[0037] Citral (6.00 g, 91.4%, 36.02 mmol) and acetone (9.28 g, 99.5 %, 158.98 mmol) are kept under argon in a 2-neck-flask. Ambersep 900 OH (1.08 g) is added and the reaction mixture is stirred at 62 °C for 2.5 h. The reaction mixture is filtered and the ion exchanger washed once with acetone after the reaction. The combined organic phases are concentrated in vacuo at 40 °C and 30 mbar yielding 74% of pseudo-ionone. The reaction is repeated using the recycled catalyst from above without further treatment yielding in the second run 75% of pseudoionone.
Example 4
[0038] Citral (2.00 g, 95.0%, 12.5 mmol) and 2-pentanone (4.80 g, 99.0%, 55.2 mmol) are stirred under argon in a 2-neck-flask at 60 °C. After the addition of Ambersep 900 OH (360 mg) the mixture was stirred for 21 h at 60 °C. The reaction mixture is filtered, once washed with 2-pentanone and concentrated in vacuum yielding 95% of 8,12-dimethyl-trideca-5,7,11-trien-4-one (selectivity 98%).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.47 (dd, J = 11.5 Hz, 14.2 Hz, HC(6)); 7.44 (dd, J = 11.5 Hz, 15.2 Hz, HC(6)); 6.11 (d, J = 15.3 Hz, HC(5) or HC(7)); 6.07 (d, J = 15.2 Hz, HC(5) or HC(7)); 5.99 (d, J = 11.4 Hz, HC(5) or HC(7)); 5.12 (m, HC(11)); 2.53 (t, J = 7.3 Hz, H2C(3) or H2C(9)); 2.52 (t, J = 7.2 Hz, H2C(3) or H2C(9)); 2.32 (t, J = 7.9 Hz, H2C(3) or H2C(9)); 2.16 (s, CH3), 1.90 (s, CH3), 1.68 (m, CH2, H2C(2)andH2C(10)); 1.61 (s, CH3), 0.95 (t, J = 7.4 Hz, H3C(1)); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 201.0 (CO), 150.9 (C=C), 150.9 (C=C), 138.6 (C=C), 138.4 (C=C), 132.6 (C=C), 132.2 (C=C), 127.6 (C=C), 127.4 (C=C), 124.7 (C=C), 123.8 (C=C), 123.3 (C=C), 123.2 (C=C), 42.8, 42.7, 40.4, 33.0, 26.9, 26.3, 25.7, 24.6, 18.0, 17.9, 17.7, 17.5, 13.9.
Example 5
[0039] 3-Methylbutyraldehyde (isovaleraldehyde) (2.00 g, 98.0%, 22.8 mmol) and acetone (5.40 g, 99.5%, 92.5 mmol) are stirred under argon in a 2-neck-flask at 60 °C. After the addition of Amberlyst A 26 (OH) (370 mg) the mixture was stirred for 200 min at 60 °C. The reaction mixture is filtered, once washed with acetone and concentrated in vacuum yielding 6-methyl-hept-3-ene-2-one 18% (selectivity 20%) and 4-hydroxy-6-methylheptan-2-one 64% (selectivity 73%).
Claims
1. A process for the production of α,β-unsaturated ketones, the process comprising the step of reacting an aldehyde of formula (1)
with a ketone of formula (2)
wherein R1 to R3 represent independently of each other hydrogen, a saturated or unsaturated, linear or branched hydrocarbons residue with 1 to 20 C-atoms or a cycloalkyl group with 4 to 12 C-atoms
in the presence of a strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin having
a) quaternary ammonium groups of the type -CH2N (CH3)3 as active sites, and
b) a surface area of 10 - 100 m2/g, and
c) an average pore diameter of 200-500 Å.
2. The process according to claim 1 wherein the cycloalkyl group is substituted.
3. The process according to claim 1 or 2 wherein R3 is methyl.
4. The process according to any one of claims 1 to 3 for the production of α,β-unsaturated ketones of formula (3)
the process comprising reacting an alkylketone of formula (4)
and an aldehyde of formula (5)
wherein
R4 represents a saturated or unsaturated, linear or branched hydrocarbons residue with 1 to 20 C-atoms and
R5 represents hydrogen, a saturated or unsaturated, linear or branched hydrocarbons residue with 1 to 20 C-atoms or a cycloalkyl group with 4 to 12 C-atoms and
n represents a number from 0 to 4 and
the dotted lines indicate, independently of each other, either a saturated or a double bond.
5. The process according to claim 4, wherein the cycloalkyl group is substituted.
6. The process according to claim 4 or 5 wherein R4 is a linear, saturated hydrocarbon residue with 1 to 5 C-atoms.
7. The process according to any one of claims 4 to 6, wherein n represent a number from 1 to 2.
8. The process according to anyone of claim 4 to 7, wherein the aldehyde of formula (5) is citral.
9. The process according to claim 8 wherein the alkylketone is selected from acetone, 2-pentanone, diethyl ketone or 2-butanone.
10. The process according to claim 1 wherein the aldehyde is 3-methylbutyraldehyd and the alkylketone is selected from acetone, 2-butanone or 2-pentanone.
11. The process according to any of claims 1 to 10, wherein the basic, anionic, macroreticular polymeric resin has a surface area of 30 m2/g and an average pore diameter of 290-300 Å.
12. The process according to any of claims 1 to 11, wherein the strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin is a resin based on a crosslinked polystyrene divinylbenzene copolymer.
13. The process according to any of claims 1 to 11, wherein the counter ion of the strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin is OH-.
14. The process according to any of claim 1 to 13, wherein the molar ratio of the aldehyde to the ketone is in the range of 1:3 to 1:10.
15. The process according to any of claim 1 to 13, wherein the molar ratio of the aldehyde to the ketone is in the range of 1:4 to 1:8.
16. The process according to any of claim 1 to 13, wherein the molar ratio of the aldehyde to the ketone is in the range1:8.
17. The process according to any of claims 1 to 16, wherein the strongly basic, anionic, macroreticular polymeric resin is filtrated and re-used in a subsequent reaction cycle.
18. The process according to any of claims 1 to 17, wherein the process is repeated 4 times using the recycled solid catalyst. | Translation - Italian
“Reazione di condensazione aldolica e catalizzatore per la stessa”
* * * * *
DESCRIZIONE
La presente invenzione è relativa a nuovi procedimenti per reazioni aldoliche incrociate con l’utilizzo di una resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica con un gruppo attivo -CH2N (CH3)3 in qualità di catalizzatore eterogeneo. Questo catalizzatore è riciclabile e il procedimento può venire ripetuto parecchie volte.
Le reazioni aldoliche sono importanti nella produzione di intermedi occorrenti per sintetizzare molti prodotti importanti da un punto di vista commerciale. L’addizione di chetoni e/o aldeidi allo scopo di ottenere aldoli (β-idrossichetoni) è una reazione ben nota. La disidratazione dell’aldolo risultante ad ottenere un chetone α,β-insaturo è anch’essa nota. La successiva idrogenazione catalitica del chetone insaturo può venire condotta allo scopo di ottenere il corrispondente chetone superiore saturo. Tuttavia, i materiali di partenza, i β-idrossichetoni intermedi come pure i chetoni α,β-insaturi notoriamente, per le persone esperte del mestiere, sono decisamente reattivi e soggetti a ulteriori reazioni consecutive, non selettive, di condensazione, ciclizzazione e addizione di tipo Michael con i chetoni e le aldeidi di partenza nonchè con se stessi e con altri chetoni e aldeidi formati come prodotti collaterali.
Nel mestiere sono stati rivelati molti metodi per l’esecuzione delle reazioni di condensazione aldolica. Questi metodi includono per esempio reazioni aldoliche omogenee catalizzate mediante basi come sono rivelate nelle pubblicazioni brevettuali WO 2004041764 o CN 1202065. Tuttavia, le reazioni aldoliche catalizzate con catalizzatore omogeneo hanno lo svantaggio di presentare un elevato contenuto di sali che produce spesso come conseguenza un’indesiderata contaminazione del prodotto finale. Reazioni catalizzate con catalizzatori eterogenei sono anch’esse rivelate in qualità di metodi versatili per la catalisi di reazioni aldoliche. La catalisi eterogenea è di importanza fondamentale nell’industria chimica a motivo della sua “semplicità” per il fatto che il catalizzatore può venire rimosso mediante filtrazione.
Varie resine scambiatrici di anioni sono descritte allo scopo di catalizzare le reazioni di condensazione aldolica, per esempio resine scambiatrici di anioni polistireniche fortemente basiche per la condensazione di citrale e acetone [Z. Nengfang; L., Guiyun. Lizi Jiaohuan Yu Xifu: (1991), 7(2), 142-146, L. Tianhua et al: Jiangsu Shiyou Huagong Xueyuan Xuebao (1998), 10(1), 15-18] o uno ione fluoruro supportato su resina scambiatrice di anioni [Lin, Hong-wei. Hecheng Huaxue (2004), 12(4), 402-404]. Tuttavia, non viene fornita alcuna informazione dettagliata relativa alle proprietà del catalizzatore.
Il brevetto polacco PL 147748 rivela la preparazione di iononi e metiliononi mediante la condensazione di citrale con acetone o metil etil chetone (2-butanone) con l’utilizzo di catalizzatori scambiatori di anioni debolmente basici. Tuttavia, il catalizzatore ha una struttura di gel e non può venire riciclato in una maniera versatile.
Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa (1997), 9(3), 59-64 rivela l’utilizzo di una resina macroporosa scambiatrice di ioni fortemente basica per la preparazione di pseudoionone. Tuttavia, le quantità occorrenti di scambiatore di ioni sono grandi e la durata della sua vita è breve, di modo che il procedimento non è economico.
Così, continua a sussistere il bisogno di un metodo semplice, economicamente attraente, altamente selettivo e favorevole da un punto di vista ambientale che permetta di formare i prodotti di condensazione aldolica in rese e purezze buone e che permetta di riciclare il catalizzatore per mezzo di un procedimento industriale semplice e che renda possibile garantire rese costantemente stabili e condizioni di processo costantemente stabili con l’utilizzo ripetuto del catalizzatore.
Come risultato di studi di vagliatura estesi, è stato sorprendentemente scoperto che l’obiettivo della presente invenzione viene realizzato mediante l’utilizzo di una resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica avente gruppi ammonio quaternario in qualità di siti attivi come catalizzatore per l’esecuzione della reazione di condensazione aldolica, in particolare un catalizzatore con un'area superficiale di 10-100 m2/g, preferenzialmente di 20-50 m2/g, in particolare con un'area superficiale di 30 m2/g, e con un diametro medio dei pori di 200-500 Å, in particolare di 290 - 300 Å.
Così, la presente invenzione è relativa ad un procedimento per la preparazione di chetoni α,β-insaturi, il procedimento comprendendo lo stadio di far reagire un’aldeide di formula (1)
con un chetone di formula (2)
in cui R1, R2 e R3 rappresentano, indipendentemente uno dall'altro, idrogeno, un residuo idrocarburico saturo o insaturo, ramificato o non ramificato, con da 1 a 20 atomi di carbonio o un gruppo cicloalchilico con da 4 a 12 atomi di carbonio, che può essere eventualmente sostituito per esempio mediante uno o più gruppi metossilici in presenza di una resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica avente:
a) gruppi ammonio quaternario del tipo -CH2N (CH3)3 come siti attivi
b) un'area superficiale di 10 - 100 m2/g, preferenzialmente di 20 - 50 m2/g, in particolare un'area superficiale di 30 m2/g, e
c) un diametro medio dei pori di 200-500 Å, in particolare di 290 - 300 Å.
Nel seguito, la resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica secondo la presente invenzione viene abbreviata come “catalizzatore solido”.
Sorprendentemente, è stato scoperto che nel caso del citrale, con l’utilizzo di metilchetoni asimmetrici è possibile ottenere una selettività elevata verso l’addizione al gruppo metilico. Così, in una forma preferenziale di esecuzione, la presente invenzione è relativa ad un procedimento per la preparazione di chetoni α,β-insaturi come è illustrato a grandi linee in quanto precede, in cui l’aldeide è citrale, R3 è metile e R2 è scelto tra un residuo idrocarburico saturo o insaturo, ramificato o non ramificato, con da 1 a 20 atomi di carbonio o un gruppo cicloalchilico con da 4 a 12 atomi di carbonio, che può essere eventualmente sostituito per esempio mediante uno o più gruppi metossilici.
Il seguente schema illustra la reazione di condensazione aldolica secondo la presente invenzione in cui si passa attraverso il composto tra parentesi come intermedio.
[“Aldol Addition” = addizione aldolica]
L’addizione del chetone alle aldeidi produce come risultato un aldolo intermedio (β-idrossichetone) che viene disidratato in situ a dare il rispettivo chetone α,β-insaturo. Questa reazione viene catalizzata per mezzo del catalizzatore solido secondo la presente invenzione.
In un’altra forma preferenziale di esecuzione, la presente invenzione è relativa ad un procedimento per la produzione di chetoni α,β-insaturi di formula (3)
il procedimento comprendendo la reazione di un alchil chetone di formula (4)
e una aldeide di formula (5)
in cui
R4 rappresenta un residuo idrocarburico saturo o insaturo, lineare o ramificato con da 1 a 20 atomi di carbonio, preferenzialmente un residuo idrocarburico saturo o insaturo con da 1 a 10 atomi di carbonio, più preferibilmente un idrocarburo saturo con da 1 a 5 atomi di carbonio (cioè 1, 2, 3, 4, o 5 atomi di carbonio), e
R5 rappresenta idrogeno, un residuo idrocarburico saturo o insaturo, lineare o ramificato con da 1 a 20 atomi di carbonio o un gruppo cicloalchilico con da 4 a 12 atomi di carbonio che può essere eventualmente sostituito per esempio mediante uno o più gruppi metossilici o gruppi etere, preferenzialmente rappresenta idrogeno, e
n rappresenta un numero da 0 a 4, preferenzialmente da 0 a 2 e
in cui le linee punteggiate indicano, indipendentemente una dall’altra, o un legame saturo o un doppio legame e, se le linee punteggiate rappresentano un doppio legame, esso può essere disposto in una delle due posizioni indicate e
in cui il procedimento viene condotto in presenza di una resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica avente
a) gruppi ammonio quaternario del tipo -CH2N (CH3)3 come siti attivi e
b) un'area superficiale di 10 - 100 m2/g, preferenzialmente di 20 - 50 m2/g, in particolare un'area superficiale di 30 m2/g, e
c) un diametro medio dei pori di 200-500 Å, in particolare di 290 - 300 Å.
Particolarmente preferito è un procedimento come illustrato a grandi linee in quanto precede in cui R4 è un residuo idrocarburico lineare saturo con da 1 a 5 atomi di carbonio e n rappresenta un numero da 1 a 2 e il controione della resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica è OH-. In maniera massimamente preferibile, l’aldeide è il citrale, R4 è un residuo idrocarburico saturo, lineare con da 1 a 5 atomi di carbonio e n rappresenta un numero da 1 a 2 e il controione della resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica è OH-.
In tutte le forme di realizzazione della presente invenzione, il catalizzatore preferenzialmente viene riciclato dopo la terminazione della reazione mediante filtrazione, eventualmente viene lavato con un alcol, preferenzialmente con etanolo, e viene riutilizzato in un successivo ciclo di reazione. Preferenzialmente, il procedimento secondo la presente invenzione, incluso il riciclaggio del catalizzatore solido, viene ripetuto almeno una volta con l’utilizzo del catalizzatore riciclato, in maniera ancora più preferibile il catalizzatore viene riutilizzato da 2 a 10 volte, come per esempio 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 volte, in particolare 4 volte nel procedimento secondo la presente invenzione.
In tutte le forme di realizzazione della presente invenzione, il catalizzatore solido preferenzialmente è una resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica basata su un copolimero stirene divinilbenzene reticolato contenente gruppi -CH2N (CH3)3 in qualità di siti attivi.
Il controione del catalizzatore solido portante carica positiva secondo la presente invenzione può venire scelto tra qualsiasi ione portante carica negativa, quali Cl-, Br- o OH-. In tutte le forme di realizzazione della presente invenzione, il controione è preferenzialmente OH-. La concentrazione dei siti attivi è preferenzialmente >0,7 eq/l, in maniera massimamente preferibile è maggiore o uguale a 0,8 eq/l. I catalizzatori solidi per i procedimenti secondo la presente invenzione possono venire preparati mediante metodi noti ad una persona esperta del mestiere, oppure possono venire ottenuti per esempio dalla Rohm & Haas sotto la denominazione commerciale di Amberlyst 26 OH o di Ambersep 900.
Chetoni adatti per il procedimento secondo la presente invenzione includono acetone, metil etil chetone (2-butanone), dietil chetone (3-pentanone), metil propil chetone (cioè 2-pentanone), 3-metilbutirraldeide (cioè isovaleraldeide), metil n-butil chetone (2-esanone), metil isobutil chetone, metil-tert.-butil chetone senza essere limitati a questi. Preferenzialmente, il chetone è scelto tra acetone, 2-pentanone o 2-butanone.
Aldeidi esemplificative per il procedimento includono paraformaldeide, 3-metilbutirraldeide, aldeide 3-metil crotonica, eptanale, citrale, 3,7-dimetil-2-ottenale o 3,7-dimetil-1-ottanale senza essere limitati a queste. Aldeidi preferite secondo la presente invenzione sono paraformaldeide, eptanale, 3-metilbutirraldeide e citrale.
In una forma preferenziale di esecuzione ulteriore, la presente invenzione è relativa ad un procedimento secondo la presente invenzione nel quale la aldeide di formula (5) è il citrale.
Per di più, il procedimento secondo la presente invenzione è adatto particolarmente per la conduzione della condensazione aldolica del citrale (formula (5) n = 1) con acetone (formula (4) R4 = metile, R5 = idrogeno) a dare lo ψ-ionone (formula (3) R4 = metile, R5 = idrogeno, n = 1) o rispettivamente del citrale (formula (5) n = 1) con 2-pentanone (formula (4) R4 = propile, R5 = idrogeno) a fornire l'8,12-dimetil-5,7,11-tridecatrien-4-one (formula (3) R4 = propile, R5 = idrogeno, n = 1) nonchè di 3-metilbutirraldeide (formula (5) n = 0) con acetone a dare il 6-metil-ept-3-en-2-one (formula (3), R4 = metile, R5 = idrogeno, n = 0) come è illustrato nello schema presentato qui sotto:
[“citral” = citrale;
“acetone” = acetone;
“solid catalyst” = catalizzatore solido;
“pseudoionone” = pseudoionone;
“2-pentanone” = 2-pentanone;
“8,12-dimethyl-5,7,11-tridecatrien-4-one” = 8,12-dimetil-5,7,11-tridecatrien-4-one;
“3-methylbutyraldehyde” = 3-metilbutirraldeide;
“6-methyl-hept-3-ene-2-one” = 6-metil-ept-3-en-2-one]
Lo ψ -ionone, l'8,12-dimetil-5,7,11-tridecatrien-4-one come pure il 6-metil-ept-3-en-2-one sono degli importanti intermedi per la produzione di vitamine e di profumi, per esempio per la produzione di timberone, geraniolo, nerolo, geranil acetone, neril acetone, linaloolo, diidrolinaloolo, isonalina, vitamina E, vitamina A e β-carotene.
Così, in una forma di realizzazione particolare, la presente invenzione è relativa ad un procedimento secondo la presente invenzione con tutte le preferenze e le definizioni qui fornite, in cui l’alchilchetone e l’aldeide sono scelti tra
(i) citrale e acetone e/o
(ii) citrale e 2-pentanone e/o
(iii) citrale e dietil chetone e/o
(iv) citrale e 2-butanone e/o
(v) 3-metilbutirraldeide e acetone e/o
(vi) 3-metilbutirraldeide e 2-butanone e/o
(vi) 3-metilbutirraldeide e 2-pentanone e/o
(vii) eptanale e 2-butanone e/o
(viii) eptanale e acetone.
Un particolare vantaggio del procedimento della presente invenzione è costituito dall’utilizzo del catalizzatore solido che presenta una stabilità eccezionale e che permette una semplice rigenerazione mediante filtrazione. Pertanto, il catalizzatore solido può venire riutilizzato mantenendo la sua attività. Dopo la filtrazione, il catalizzatore solido può venire rigenerato mediante metodi noti ad una persona esperta del mestiere. Per esempio, il catalizzatore solido può venire rigenerato mediante il lavaggio con un solvente polare come metanolo o etanolo seguito da un trattamento con idrossido di sodio (NaOH) acquoso (per esempio NaOH 1 M). Dopo il trattamento basico, il catalizzatore viene lavato con acqua fino a quando l’eluato non è neutro, operazione seguita da lavaggio con un solvente polare come in particolare etanolo. Dopo di ciò, il catalizzatore solido è pronto per essere utilizzato nel procedimento secondo la presente invenzione.
Il catalizzatore può venire utilizzato tale e quale oppure esso può venire sospeso prima del suo utilizzo. In una forma preferenziale di esecuzione della presente invenzione, il catalizzatore solido viene sospeso in un solvente polare quale metanolo o etanolo, in particolare etanolo. Dopo la terminazione della reazione, il catalizzatore può venire riciclato mediante misure tecniche semplici, come per esempio filtrazione o decantazione.
La quantità del catalizzatore solido utilizzata nei procedimenti secondo la presente invenzione è basata sulla quantità di aldeide. Solitamente, la quantità del catalizzatore solido viene scelta in modo che sia in un campo dal 15 al 50% in moli, preferenzialmente dal 20 al 40 % in moli, in particolare nell’intervallo dal 25 al 35 % in moli, in maniera massimamente particolare il 33 % in moli sulla base dell’aldeide. La percentuale in moli di catalizzatore da utilizzarsi viene calcolata sulla base dei suoi siti attivi. Tali quantità di catalizzatore solido sono sufficienti per ottenere rese elevate del prodotto desiderato.
Il procedimento secondo la presente invenzione può venire condotto senza un solvente addizionale, oppure in presenza di un solvente addizionale. Solventi adatti per la reazione di condensazione aldolica sono solventi polari protici, per esempio metanolo o etanolo. Preferenzialmente, la reazione viene condotta con l’utilizzo di etanolo. In un’altra forma preferenziale di esecuzione, la reazione viene condotta in assenza di solventi.
Il rapporto di chetone su aldeide non è critico per la reazione e può variare entro un ampio intervallo, anche se normalmente il chetone viene utilizzato come componente in eccesso allo scopo di ottenere un’elevata selettività di prodotto in relazione all’aldeide. Buoni risultati vengono ottenuti se viene utilizzato un rapporto in moli dell’aldeide sul chetone da 1:0,5 a 1: 50, preferenzialmente da 1:1 a 1:30, in maniera massimamente preferibile compreso nell’intervallo da 1:3 a 1:10, in particolare nell’intervallo da 1:4 a 1:8, in maniera massimamente particolare nel rapporto di 1:8. Vantaggiosamente, viene utilizzato un eccesso del chetone nel procedimento secondo la presente invenzione.
La reazione può venire eseguita a varie temperature e varie pressioni, i valori ottimali essendo definiti dai materiali di partenza utilizzati. Generalmente, le temperature di reazione possono variare da - 20 a 100°C. Preferenzialmente, la temperatura di reazione è scelta nell’intervallo da 20 a 60°C, in particolare nell’intervallo da 40 a 60°C, in particolare pari a 60°C. Le pressioni possono variare da 0,1 a 100 bar assoluti. Preferenzialmente, la reazione viene condotta a pressione atmosferica.
Il procedimento secondo la presente invenzione in linea di principio può venire condotto in qualsiasi reattore adatto per reazioni catalizzate con catalizzatore eterogeneo. Senza limitare la generalità, i seguenti vengono citati a scopo di esempio: reattore in sospensione, tino agitato, cascata di tini agitati, reattore tubolare, reattore del tipo a fascio tubiero, reattore del tipo a guscio, reattore a letto fisso, reattore a letto fluidizzato, colonna di distillazione reattiva.
La presente invenzione viene illustrata ulteriormente per mezzo degli esempi, senza essere limitata ad essi.
Esempio 1
Paraformaldeide (63,3 mmol, 1 equiv.), acetone (26 equiv.) e il 25 % in peso (sulla base della paraformaldeide) di Amberlyst A 26 OH vengono miscelati in un pallone a fondo rotondo e il pallone viene introdotto in un bagno di olio preriscaldato a 50°C. La miscela di reazione viene tenuta sotto agitazione per 23,5 ore, filtrata e analizzata ottenendo come risultato una resa del 10% di idrossibutan-2-one.
La stessa reazione viene ripetuta con l’utilizzo del 25 % in peso (sulla base della paraformaldeide) di Ambersep 900 OH ottenendo come risultato una resa di 4-idrossibutan-2-one del 13%.
L’utilizzo di uno scambiatore di anioni debolmente basico come la Amberlite IRA-96 ha prodotto come risultato la totale assenza di conversione.
Esempio 2
3 g di Amberlyst A 26 OH vengono posti sotto agitazione per 15 min in 50 di etanolo. Il solvente viene decantato. Dopo l’aggiunta di 50 ml di etanolo, la miscela di reazione viene riscaldata a 40°C, rispettivamente a 60°C. Citrale (0,65 g, 11,1 mmol) e una quantità adatta di acetone allo scopo di ottenere i rapporti in moli indicati, mostrati in tabella 1, vengono aggiunti in una sola volta e la miscela di reazione viene tenuta sotto agitazione per 3 ore a 40°C/ 60°C. La miscela di reazione viene decantata e lo scambiatore di ioni viene lavato due volte con 25 ml di etanolo. Le fasi organiche combinate vengono concentrate sotto vuoto a 40°C e 30 mbar. La resa di pseudoionone è fornita qui sotto in tabella. Il catalizzatore viene riutilizzato per ogni prova senza un ulteriore trattamento.
Tabella 1
Prova Acetone citrale 1:1* Acetone citrale 4:1* Acetone citrale 8:1*
resa [%]40°C resa [%]60°C resa [%] 40°C resa [%]60°C resa [%]40°C resa [%]60°C
1 23 50 54 62 66 68
2 18 38 53 60 65 67
3 13 32 46 60 62 69
4 6 17 32 62 49 77
5 10 39 36 43
* rapporto basato sulla quantità molare
La reazione illustrata a grandi linee qui sopra con l’utilizzo di citrale e acetone è stata ripetuta utilizzando uno scambiatore di anioni debolmente basico, cioè la Amberlite IRA-96. Tuttavia non è stato possibile ottenere assolutamente alcuna conversione.
Esempio 3
Citrale (6,00 g, 91,4%, 36,02 mmol) e acetone (9,28 g, 99,5 %, 158,98 mmol) vengono mantenuti sotto argon in un pallone a 2 colli. Viene aggiunta Ambersep 900 OH (1,08 g) e la miscela di reazione viene tenuta sotto agitazione a 62°C per 2,5 ore. La miscela di reazione viene filtrata e lo scambiatore di ioni viene lavato una volta con acetone dopo la reazione. Le fasi organiche combinate vengono concentrate sotto vuoto a 40°C e 30 mbar fornendo una resa del 74% di pseudo-ionone. La reazione viene ripetuta utilizzando il catalizzatore riciclato di cui sopra senza ulteriore trattamento fornendo nella seconda prova il 75% di pseudoionone.
Esempio 4
Citrale (2,00 g, 95,0%, 12,5 mmol) e 2-pentanone (4,80 g, 99,0%, 55,2 mmol) vengono posti sotto agitazione sotto argon in un pallone a due colli a 60°C. Dopo l’aggiunta di Ambersep 900 OH (360 mg), la miscela è stata tenuta sotto agitazione per 21 ore a 60°C. La miscela di reazione viene filtrata, lavata una volta con 2-pentanone e viene concentrata sotto vuoto fornendo il 95% di 8,12-dimetil-trideca-5,7,11-trien-4-one (selettività del 98%).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7,47 (dd, J = 11,5 Hz, 14,2 Hz, HC(6)); 7,44 (dd, J = 11,5 Hz, 15,2 Hz, HC(6)); 6,11 (d, J = 15,3 Hz, HC(5) o HC(7)); 6,07 (d, J = 15,2 Hz, HC(5) o HC(7)); 5,99 (d, J = 11,4 Hz, HC(5) o HC(7)); 5,12 (m, HC(11)); 2,53 (t, J = 7,3 Hz, H2C(3) o H2C(9)); 2,52 (t, J = 7,2 Hz, H2C(3) o H2C(9)); 2,32 (t, J = 7,9 Hz, H2C(3) o H2C(9)); 2,16 (s, CH3), 1,90 (s, CH3), 1,68 (m, CH2, H2C(2) e H2C(10)); 1,61 (s, CH3), 0,95 (t, J = 7,4 Hz, H3C(1));
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 201,0 (CO), 150,9 (C=C), 150,9 (C=C), 138,6 (C=C), 138,4 (C=C), 132,6 (C=C), 132,2 (C=C), 127,6 (C=C), 127,4 (C=C), 124,7 (C=C), 123,8 (C=C), 123,3 (C=C), 123,2 (C=C), 42,8, 42,7, 40,4, 33,0, 26,9, 26,3, 25,7, 24,6, 18,0, 17,9, 17,7, 17,5, 13,9.
Esempio 5
3-Metilbutirraldeide (isovaleraldeide) (2,00 g, 98,0%, 22,8 mmol) e acetone (5,40 g, 99,5%, 92,5 mmol) vengono posti sotto agitazione sotto argon in un pallone a due colli a 60°C. Dopo l’aggiunta di Amberlyst A 26 (OH) (370 mg), la miscela è stata tenuta sotto agitazione per 200 minuti a 60°C. La miscela di reazione viene filtrata, lavata una volta con acetone e concentrata sotto vuoto fornendo il 6-metil-ept-3-en-2-one 18% (selettività del 20%) e 4-idrossi-6-metileptan-2-one 64% (selettività del 73%).
RIVENDICAZIONI
1. Un procedimento per la produzione di chetoni α,β-insaturi, il procedimento comprendendo lo stadio di far reagire un’aldeide di formula (1)
con un chetone di formula (2)
in cui da R1 a R3 rappresentano, indipendentemente uno dall'altro, idrogeno, un residuo idrocarburico saturo o insaturo, lineare o ramificato, con da 1 a 20 atomi di carbonio o un gruppo cicloalchilico con da 4 a 12 atomi di carbonio
in presenza di una resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica avente
a) gruppi ammonio quaternario del tipo -CH2N (CH3)3 come siti attivi, e
b) un'area superficiale di 10 - 100 m2/g, e
c) un diametro medio dei pori di 200-500 Å.
2. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui il gruppo cicloalchilico è sostituito.
3. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui R3 è metile.
4. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 3 per la produzione di chetoni α,β-insaturi di formula (3)
il procedimento comprendendo la reazione di un alchilchetone di formula (4)
e un'aldeide di formula (5)
in cui
R4 rappresenta un residuo idrocarburico saturo o insaturo, lineare o ramificato con da 1 a 20 atomi di carbonio e
R5 rappresenta idrogeno, un residuo idrocarburico saturo o insaturo, lineare o ramificato con da 1 a 20 atomi di carbonio o un gruppo cicloalchilico con da 4 a 12 atomi di carbonio e
n rappresenta un numero da 0 a 4 e
le linee punteggiate indicano, indipendentemente una dall’altra, o un legame saturo o un doppio legame.
5. Il procedimento secondo la rivendicazione 4 in cui il gruppo cicloalchilico è sostituito.
6. Il procedimento secondo la rivendicazione 4 o 5 in cui R4 è un residuo idrocarburico saturo lineare con da 1 a 5 atomi di carbonio.
7. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 4 a 6 in cui n rappresenta un numero da 1 a 2.
8. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 4 a 7 in cui l'aldeide di formula (5) è il citrale.
9. Il procedimento secondo la rivendicazione 8 in cui l’alchilchetone è scelto tra acetone, 2-pentanone, dietil chetone o 2-butanone.
10. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui l’aldeide è la 3-metilbutirraldeide e l’alchilchetone è scelto tra l' acetone, il 2-butanone o il 2-pentanone.
11. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 10 in cui la resina polimerica macroreticolare anionica basica presenta un'area superficiale di 30 m2/g e un diametro medio dei pori di 290-300 Å.
12. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11 in cui la resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica è una resina basata su un copolimero polistirene-divinilbenzene reticolato.
13. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11 in cui il controione della resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica è OH-.
14. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 13 in cui il rapporto in moli dell’aldeide sul chetone è compreso nell’intervallo da 1:3 a 1:10.
15. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 13 in cui il rapporto in moli dell’aldeide sul chetone è compreso nell’intervallo da 1:4 a 1:8.
16. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 13 in cui il rapporto in moli dell’aldeide sul chetone è compreso nell’intervallo di 1:8.
17. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 16 in cui la resina polimerica macroreticolare anionica fortemente basica viene filtrata e riutilizzata in un successivo ciclo di reazione.
18. Il procedimento secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 17 in cui il procedimento viene ripetuto quattro volte con l’utilizzo del catalizzatore solido riciclato.
| German to Italian: Gaszaehler
General field: Law/Patents
Detailed field: Engineering (general) | Source text - German
see EP 1290412
(not yet available in text form) | Translation - Italian
“Contatore di gas e procedimento per la determinazione del consumo di una miscela di gas”
* * * * *
DESCRIZIONE
Campo tecnico
La presente invenzione è relativa ad un procedimento per la determinazione del consumo di una miscela di gas e ad un contatore di gas conforme al preambolo della rivendicazione 1 e rispettivamente della rivendicazione 8. Il procedimento e il contatore di gas sono adatti in particolare per l'utilizzo nel settore domestico e professionale e in particolare per la determinazione del prelievo di gas naturale.
Stato della tecnica
Oggi i conteggi del gas, in particolare nel settore domestico e professionale, sono basati esclusivamente sul volume di gas prelevato. Per questo motivo vengono impiegati soprattutto dei contatori di gas che sono basati direttamente su una misura del volume del flusso di gas fluito attraverso di essi, dove essi compensano parzialmente gli errori di misura che hanno origine da variazioni della temperatura.
Il contatore di gas impiegato decisamente con maggiore frequenza è il cosiddetto contatore di gas a soffietto, come è descritto in U. Wernekinck, Gasmessung und Gasabrechnung, Vulkan-Verl. 1996, 20-31. Il contatore di gas a soffietto dispone di due camere di misura che vengono riempite alternatamente una dopo l'altra mediante il gas che vi fluisce attraverso e vengono nuovamente svuotate. Mentre una camera si riempie, essa scaccia il gas contenuto nell'altra. I riempimenti e rispettivamente gli svuotamenti vengono contati e, moltiplicati per il volume della camera di misura, forniscono il volume complessivo del gas che è fluito attraverso. Dato che il volume del gas tuttavia varia con il variare della temperatura e della pressione dell'ambiente, queste misure sono soggette ad errori. In estate, quando il gas è caldo e assume un volume più grande, il consumatore paga di più, per lo stesso valore calorimetrico del gas, che non in inverno. Per i contatori di gas a soffietto di oggi esistono pertanto dei semplici dispositivi meccanici o elettrici per la compensazione della temperatura, nella pratica d'altra parte questi vengono raramente impiegati. Tuttavia le fluttuazioni di pressione non vengono prese in considerazione.
Dalla pubblicazione brevettuale internazionale WO 99/06800 è noto un contatore di gas che determina una portata volumetrica. A questo scopo, in un tubo del gas per mezzo di un primo termistore viene rilevato il comportamento di raffreddamento e per mezzo di un secondo termistore viene rilevata la temperatura effettiva del gas e da questi valori si determina una portata delle molecole di gas. Nel tubo è inoltre disposta una cella nella quale viene rilevato il comportamento di raffreddamento di gas fermo. In questa maniera, durante il funzionamento della conduttura di gas, è possibile ottenere in un qualsiasi momento un valore di taratura. Per mezzo di questo valore di taratura è possibile ora determinare a sua volta, dal comportamento di raffreddamento del primo termistore, la portata volumetrica.
Nonostante tutte queste compensazioni, i contatori di gas che sono basati su misure volumetriche sono sempre affetti da errori e portano ad un conteggio non corretto del gas. Per di più, un principio di conteggio che è basato su un consumo volumetrico è scorretto (unfair) nei confronti del consumatore. Il suo consumo di gas si calcola infatti non in base al volume, bensì in base alla quantità di gas, il che vuol dire alla massa consumata di gas, nonché in base alla qualità del gas, il che vuol dire il suo potere calorifico. Quanto più è denso e quanto più è di livello qualitativo elevato il gas, tanto minore è il volume occorrente per l'ottenimento dello stesso rendimento, indipendentemente dal fatto che questo si verifichi in un riscaldamento, in una preparazione di acqua calda o in un fornello.
Nella domanda di brevetto tedesco non ancora pubblicata numero 199 08 664.8 viene per questo motivo descritto un contatore di gas che determina la portata di massa del gas e tiene conto in questa maniera della densità del gas. A questo scopo viene impiegato preferenzialmente un anemometro, come è noto da F. Mayer et al., Single-Chip CMOS Anemometer, Proc. IEEE, International Electron Devices Meeting (IEDM, 1997), 895-898.
Nei contatori di gas descritti qui sopra, non viene tuttavia tenuto conto delle fluttuazioni della qualità del gas. Queste fluttuazioni sono considerevoli soprattutto nel caso del gas naturale e hanno origine principalmente dal fatto che il gas naturale presenta una differente composizione a seconda dell'origine. Nella conduttura di apporto del gas vengono tuttavia offerti dei gas misti che provengono da diverse origini, dove il rapporto di miscelazione può variare fortemente in funzione dell'offerta.
È vero che dallo stato della tecnica sono noti degli apparecchi che tengono conto del potere calorifico di un gas e determinano un consumo di energia. Così la pubblicazione brevettuale internazionale WO 00/11465 divulga un apparecchio per la misura dell'energia che da una parte presenta un contatore di gas a soffietto per la misura del volume e d'altra parte presenta un dispositivo per la determinazione del valore calorimetrico di un gas, dove questo dispositivo di misura calorimetrico si basa su un principio di misura acustico. Anche la pubblicazione brevettuale statunitense US-A-6.047.589 divulga l'apparecchio per la misura dell'energia che determina la portata volumetrica e il valore calorimetrico di un gas, dove qui tutte e due le misure sono basate sull'effetto acustico. Tutti e due gli apparecchi per la misura dell'energia sono pertanto tarati per la misura volumetrica, dove essi compensano di volta in volta il valore di misura volumetrico con il potere calorifico effettivamente misurato localmente per ottenere in questa maniera il valore di energia desiderato.
Il brevetto statunitense US 5,237,523 , riguarda un procedimento per la correzione di una misura di flusso di un gas nel quale viene effettuata una taratura del sensore di flusso, vengono stabiliti dei fattori di correzione per la portata di massa a temperature determinate e vengono determinati dei valori di portata corretti e questi vengono rettificati attraverso un fattore di correzione, dove la taratura deve sempre venire condotta con lo stesso gas che successivamente deve venire misurato.
Questi apparecchi per la misura dell'energia sono pertanto relativamente complicati come struttura, essi di fatto devono essere in grado di condurre sia una misura di volume che una determinazione del potere calorifico e inoltre devono essere in grado di mettere in relazione i due valori di misura ottenuti. Apparecchi di questo tipo sono pertanto troppo costosi per l'impiego come normali contatori del gas nel settore domestico e professionale.
Presentazione dell'invenzione
È pertanto compito della presente invenzione creare un procedimento per la determinazione del consumo di una miscela di gas e un contatore di gas del tipo citato all'inizio che rendano possibile in una maniera semplice la misura di un prelievo di gas in funzione del potere calorifico e che pertanto siano adatti per l'impiego nel settore domestico e professionale.
Questo problema viene risolto per mezzo di un procedimento e di un contatore di gas con gli aspetti peculiari delle rivendicazioni 1 e rispettivamente 8.
Il procedimento conforme all'invenzione parte dal fatto di aver riconosciuto che un segnale di sensore nella misura di una portata, in particolare di una portata di massa, si modifica in funzione del valore calorimetrico o potere calorifico del gas. Per di più questa subordinazione presenta una relazione fissa che in un primo ordine è un rapporto proporzionale. In questa maniera è possibile tarare il contatore di gas conforme all'invenzione direttamente come apparecchio per la misura dell'energia.
Correzioni di più ampia portata che tengano conto di fluttuazioni nella composizione della miscela di gas possono venire condotte indipendentemente dalla misura effettuata dal contatore di gas. La determinazione del potere calorifico, occorrente a questo scopo, di una miscela di gas effettivamente prelevata può venire condotta da un'unità esterna e spazialmente separata dal contatore di gas.
È vantaggioso il fatto che in questa maniera non è necessario che ogni contatore di gas sia equipaggiato di un'unità per la determinazione del potere calorifico. Una singola unità esterna è sufficiente per provvedere più consumatori e pertanto più contatori di gas che sono collegati alla stessa rete del gas delle indicazioni occorrenti relative al potere calorifico della miscela di gas prelevata.
In una variante preferita del procedimento conforme all'invenzione, questa unità esterna trasmette al contatore di gas le indicazioni relative al potere calorifico e il contatore di gas esegue esso stesso una correzione del valore di consumo di energia misurato, sulla base di queste indicazioni.
In un'altra variante preferita del procedimento, il contatore di gas fa pervenire il valore di consumo di energia, o un valore di consumo di energia integrato su un determinato intervallo di tempo, ad una centrale nella quale questo valore viene corretto con le indicazioni relative al potere calorifico presente durante questo intervallo di tempo della miscela di gas prelevata.
Ulteriori forme di realizzazione vantaggiose risultano dalle rivendicazioni dipendenti.
Breve descrizione dei disegni
Nel seguito l'oggetto della presente invenzione viene illustrato in una maniera più precisa sulla base di un esempio di realizzazione preferito che è rappresentato nei disegni allegati. Nelle figure:
Figura 1 mostra un dettaglio di una conduttura di gas con un contatore di gas conforme all'invenzione;
Figura 2 mostra un confronto di una deviazione di valori medi mensili del potere calorifico di gas naturale e delle corrispondenti variazioni del valore di misura del contatore di gas conforme all'invenzione;
Figura 3a mostra errori del valore di misura in relazione ad un valore energetico effettivo di un gas per una misura di volume,
Figura 3b per una misura di flusso di massa e
Figura 3c per una misura di flusso di energia conforme all'invenzione.
Strade per la messa in atto dell'invenzione
In figura 1 è rappresentata una conduttura di gas che è provvista di un contatore di gas conforme all'invenzione. La conduttura di gas è costituita da un tubo di conduttura principale 1 che è collegato con una conduttura della rete del gas esterna all'edificio, qui non rappresentata. Questo tubo di conduttura principale 1 presenta un restringimento del tubo 10 con una sezione trasversale definita, oppure altri mezzi (pressure dropper) inseriti nel tubo di conduttura principale 1 allo scopo di ottenere una perdita di carico (caduta di pressione) ben definita. Attraverso la conduttura di gas fluisce un gas. Generalmente a questo riguardo si tratta di una miscela di gas la cui composizione effettiva è variabile. Questa situazione si presenta per esempio nel caso del gas naturale i cui tre componenti principali, metano, propano e etano, presentano una differente ponderazione a seconda dell'origine dei gas. Questi tre componenti principali combustibili presentano tuttavia anche dei poteri calorici differenti, di modo che il potere calorifico della miscela di gas risultante fluttua in maniera corrispondente.
È presente un contatore di gas che presenta un mezzo di misura 2 per la determinazione della portata di massa dei gas nonché un'apparecchiatura elettronica di valutazione qui non rappresentata. Il mezzo di misura 2 in una forma di realizzazione semplice è disposto direttamente nel tubo di conduttura principale 1. Nella forma preferenziale di realizzazione qui rappresentata, dal tubo di conduttura principale 1 si dirama tuttavia un tubo di raccordo in parallelo 11 che forma un raccordo in parallelo (derivazione) (bypass) al restringimento del tubo 10. In questo tubo di raccordo in parallelo è disposto il mezzo di misura 2. Per quanto riguarda il mezzo di misura 2, si tratta di un anemometro a CMOS con una struttura di polisilicio in costruzione a sandwich, come è divulgato nelle pubblicazioni J. Robadey et al., Two dimensional integrated gas flow sensors by CMOS IC technology, J. Mecromech. Microeng. 5(1995) 243-250, in F. Mayer, et al., Scaling of thermal CMOS gas flow microsensors: experiment and simulation, Proc. IEEE Micro Electro Mechanical Systems, (IEEE, 1996), 116-121, nonché in F. Mayer, et al., Single-Chip CMOS Anemometer, Proc. IEEE, International Electron Devices Meeting (IEDM, 1997) 895-898 e che nella domanda di brevetto tedesco pubblicata, citata all'inizio, n° 199 08 664.8 viene proposto per l'utilizzo come contatore di gas.
Il mezzo di misura 2 presenta un elemento riscaldante e un sensore di temperatura disposto di volta in volta a monte e a valle, nella direzione della corrente, rispetto all'elemento riscaldante a distanze uguali. Un gas da misurare fluisce sopra la superficie del mezzo di misura 2 e viene riscaldato dall'elemento riscaldante. Per mezzo dei sensori di temperatura, nella direzione della corrente viene misurata a monte e a valle dell'elemento riscaldante la temperatura o rispettivamente la differenza di temperatura del gas, operazione mediante la quale viene ottenuto un segnale di sensore S nella forma di un segnale di tensione U, che è in relazione di proporzionalità con la differenza di temperatura ΔT. Il tasso di trasferimento del calore è proporzionale al numero delle molecole per unità di volume e dipende pertanto dalla massa di gas. In aggiunta però esso dipende anche dal potere calorifico della miscela di gas, e dunque dal tipo o rispettivamente dalla composizione della miscela di gas.
Conformemente all'invenzione viene ora introdotta la conoscenza del fatto che il segnale di sensore si modifica in funzione del valore calorimetrico di una miscela di gas. Questo si verifica nel caso di una taratura dello strumento come apparecchio per la misura del volume, e in maniera ancora più forte nel caso di una taratura dello strumento come misuratore della portata di massa. In figura 2 è rappresentata questa relazione. In questa figura, CW indica una deviazione percentuale dei valori medi mensili rispetto al valore medio annuale per il potere calorifico del gas naturale. Come si può vedere, il potere calorifico oscilla di circa il 2%. Parimenti è rappresentata, e indicata con ΔS, una variazione del segnale di sensore S che è stato ottenuto per mezzo del mezzo di misura 2 precedentemente descritto per un flusso di gas costante. È evidente che il segnale di sensore si modifica nella stessa direzione e addirittura in maniera quasi proporzionale rispetto al potere calorifico. Questa relazione vale non solo per i valori medi mensili, bensì ovviamente anche per i valori istantanei, il che vuol dire che è valida su una scala temporale piccola a piacere.
Conformemente all'invenzione pertanto è possibile tarare o calibrare il contatore di gas o rispettivamente il mezzo per la determinazione della portata di massa come apparecchio per la misura dell'energia. A questo scopo si procede nella maniera seguente:
In un primo stadio viene determinato un numero N di valori del segnale di sensore in funzione di una portata volumetrica o di massa per un gas di taratura, dove questa determinazione viene effettuata in condizioni normalizzate, il che vuol dire ad una temperatura determinata (per esempio 20°C) e ad una pressione determinata (per esempio a 1 bar). Come è stato presentato più su, a questo riguardo per il mezzo di misura 2 utilizzato questi valori del segnale di sensore sono proporzionali ad una portata di massa dei gas. I valori di segnale di sensore vengono invertiti e vengono memorizzati nella forma di una curva di taratura del sensore come portata in funzione del segnale di sensore S nei circuiti elettronici di valutazione del contatore di gas.
Come gas di taratura viene utilizzato conformemente all'invenzione azoto N2 o aria. La curva di taratura del sensore in un secondo stadio viene moltiplicata per un fattore di ricalcolo del segnale fN2-CH e per un fattore di potere calorifico HCH relativamente ad una miscela di gas di base caratterizzata mediante l'indice CH e viene nuovamente memorizzata. Il fattore di ricalcolo del segnale a questo riguardo è un fattore di ricalcolo che tiene conto della differenza di sensibilità del mezzo di misura 2 nel caso dell'utilizzo di una miscela di gas di base al posto del gas di taratura, in questo caso azoto. Il fattore di potere calorifico HCH tiene conto del potere calorifico di questa miscela di gas di base, il che vuol dire del suo valore calorimetrico o potere calorifico per unità della grandezza di portata, il che vuol dire per volume standard o per kilogrammo. Come miscela di gas di base viene utilizzata preferenzialmente una miscela di gas media tipica per il settore di impiego del contatore di gas.
Il prodotto ottenuto è una prestazione P in funzione del segnale di sensore S
che indica il consumo istantaneo di gas come energia per unità di tempo. Mediante integrazione su un intervallo di tempo determinato, è possibile determinare in questa maniera il consumo di energia E:
Il contatore di gas è pertanto già tarato come apparecchio per la misura dell'energia o della potenza basato sulla miscela di gas di base. Durante il suo funzionamento infatti fluttuazioni nel tempo della composizione della miscela di gas consumata, il che vuol dire deviazioni dalla composizione della miscela di gas di base, vengono tenute almeno parzialmente in considerazione in maniera automatica per mezzo di una corrispondente fluttuazione del segnale di sensore 5. A questo scopo non è indispensabile che il potere calorifico effettivo, variabile nel tempo, H, o rispettivamente la sua deviazione dal potere calorifico HCH della miscela di gas di base, venga attualizzato in maniera continua.
Come si può vedere dalla figura 2, il modo, ottenuto per mezzo della taratura conforme all'invenzione, di tenere conto delle fluttuazioni temporali nella composizione del gas è senz'altro corretto dal punto di vista qualitativo, ma non è perfetto da un punto di vista quantitativo. Un miglioramento ulteriore viene ottenuto utilizzando, al posto del potere calorifico HCH della miscela di gas di base, un potere calorifico che tiene conto almeno approssimativamente del potere calorifico della miscela di gas effettivamente prelevata. Il valore di viene determinato per esempio per mezzo di una adatta formazione del valore medio su un arco di tempo di estensione a piacere. Per la determinazione dell'energia effettivamente prelevata, il valore di consumo di energia misurato e tarato sulla miscela di gas di base viene dunque moltiplicato per un fattore di correzione .
Questo valore di viene determinato vantaggiosamente in un'unità esterna o mediante calcolo o per via sperimentale. Questa unità non è necessario che si trovi presso il corrispondente consumatore, ma può invece venire impiegata un'unica unità per tutta una rete di utenze. Questa può essere un componente di una centrale oppure può essere in collegamento di comunicazione con questa. Per la determinazione del potere calorifico possono venire impiegati dei mezzi noti. È vantaggioso a questo riguardo il fatto che a questo scopo possono venire impiegati anche dei mezzi di misura precisi e costosi, per il fatto che effettivamente è necessario solo un unico apparecchio. Questa unità esterna misura pertanto in ogni momento o in momenti determinati il potere calorifico della miscela di gas che fluisce attraverso la rete delle utenze e memorizza su di sé questo valore.
In una variante della presente invenzione, l'unità esterna fornisce, al contatore di gas o ad ogni contatore di gas della rete di utenze, indicazioni relative al potere calorifico della miscela di gas prelevata. Questa operazione può venire effettuata a intervalli di tempo predeterminati oppure nel caso di una forte variazione della miscela di gas. Il contatore di gas in questa variante presenta degli elementi di calcolo per la correzione del valore di consumo di energia misurato con le indicazioni relative al potere calorifico. A questo riguardo, le indicazioni sono costituite dal fattore di correzione, dal potere calorifico o da un codice che può venire associato al fattore di correzione. In una variante preferita, a questo riguardo il contatore di gas integra il valore di consumo di energia misurato su un determinato intervallo di tempo i, per esempio una settimana o un mese, e moltiplica questo valore per il fattore di correzione che contiene un potere calorifico mediato sullo i-esimo intervallo di tempo . In questa maniera, per il consumo effettivo di energia su m intervalli di tempo viene ottenuta la seguente relazione:
e quando aggiuntivamente vengono mediati i fattori di ricalcolo del segnale
In un'altra variante del procedimento, il contatore di gas comunica il valore di consumo di energia misurato ad una centrale che moltiplica il valore di consumo di energia misurato per il fattore di correzione. Se l'unità esterna non è integrata nella centrale, allora anche essa comunica alla centrale le indicazioni relative al potere calorifico della miscela di gas prelevata. Preferenzialmente, il contatore di gas e/o l'unità esterna totalizzano o rispettivamente integrano i loro valori di misura su un determinato intervallo di tempo e trasmettono alla centrale il valore integrato.
In tutte le varianti, la correzione del valore di consumo di energia misurato può venire condotta in un momento a piacere, dunque anche solo al momento della lettura del contatore.
Il procedimento conforme all'invenzione e il contatore di gas conforme all'invenzione rendono possibile, grazie alla taratura diretta come apparecchio per la misura dell'energia, un conteggio di costo conveniente e corretto della quantità prelevata di gas. Il metodo di misura più preciso lo si può vedere dalle figure da 3a a 3c. Queste figure mostrano quanto è grande una deviazione di un valore di energia misurato da un valore effettivo di energia di una miscela di gas. A questo riguardo, la figura 3a mostra la situazione che si ha quando un contatore di gas è tarato per una misura di portata volumetrica di gas. È rappresentata la portata volumetrica in funzione dell'energia E. In questo caso, per un normale apparecchio di misura a soffietto senza compensazione aggiuntiva della temperatura. Se con un tale apparecchio viene determinata, dalla corrente volumetrica, la corrispondente energia del gas, l'errore allora assume un valore fino a /- 18 %. Le cause principali dell'errore sono fluttuazioni della temperatura che generalmente hanno al massimo un valore di circa il /- 10%, e fluttuazioni di pressione al massimo di circa il /- 5%. La figura 3b mostra un errore di misura che si è formato in conseguenza di una taratura sul flusso di massa, per esempio con il mezzo di misura 2 descritto più su. È rappresentata la portata di massa in funzione dell'energia E. L'errore massimo ammonta approssimativamente al /- 4%, dove circa il 2% ha origine dall'apparecchio di misura e un ulteriore 2% circa ha origine dalla fluttuazione nel tempo della composizione della miscela di gas o rispettivamente del potere calorifico. La figura 3c mostra l'errore di misura che si ha nel caso dell'impiego del mezzo di misura 2 succitato con la taratura conforme all'invenzione sul flusso di energia. È rappresentata la portata di energia o potenza in funzione dell'energia E. Come si può vedere dalle figure, un apparecchio tarato direttamente sulla misura del flusso di energia riproduce nel modo migliore la probabilità che il mezzo di misura in questo caso corregga automaticamente fluttuazioni temporali della composizione della miscela di gas nella direzione corretta della portata di energia.
Elenco delle cifre di riferimento
1 tubo di conduttura principale
10 restringimento del tubo
11 tubo di raccordo in derivazione
2 mezzo di misura
CW deviazione dai valori medi mensili
S valore del segnale di sensore
ΔS variazione del valore del segnale di sensore S
RIVENDICAZIONI
1. Procedimento per la determinazione di un consumo di miscela di gas per mezzo di un contatore di gas che presenta un anemometro (2) per la determinazione di una portata di massa di gas nonché un circuito elettronico di valutazione, dove a) per una calibrazione diretta del contatore di gas come apparecchio per la misura di energia o di potenza vengono determinati dei valori di segnale di sensore (Sn) di un gas di taratura in funzione della portata del gas di taratura (N2, aria) e vengono memorizzati nel contatore di gas nella forma di una curva di taratura del sensore (Fn(Sn)), b) la curva di taratura del sensore (Fn(Sn)) come portata in funzione del segnale di sensore (S) viene moltiplicata per un fattore di ricalcolo del segnale (fN2-CH) e per un fattore di potere calorifico (HCH) che tiene conto del potere calorifico per unità della grandezza di portata per una miscela di gas di base (CH), e il prodotto ottenuto indica una potenza (P) o un valore di consumo di energia (E), dove il fattore di ricalcolo del segnale (fN2-CH) tiene conto della differenza di sensibilità dell'anemometro (2) nel caso dell'utilizzo della miscela di gas di base al posto del gas di taratura,
caratterizzato dal fatto
che il gas di taratura è scelto dal gruppo costituito da N2 o aria.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che un valore di consumo di energia (E) misurato viene moltiplicato per un fattore di correzione ( /HCH) che tiene conto almeno approssimativamente del potere calorifico ( ) di una miscela di gas prelevata.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 2 caratterizzato dal fatto che il potere calorifico ( ) della miscela di gas prelevata viene determinato da un'unità esterna.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 3 caratterizzato dal fatto che l'unità esterna trasmette al contatore di gas indicazioni relative al potere calorifico ( ) della miscela di gas prelevata.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 3 caratterizzato dal fatto che il contatore di gas comunica il valore di consumo di energia misurato e l'unità esterna comunica indicazioni relative al potere calorifico ( ) della miscela di gas prelevata ad una centrale.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 3 caratterizzato dal fatto che l'unità esterna è la centrale.
7. Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che il fattore di correzione ( /HCH) tiene conto di un potere calorifico ( ) della miscela di gas prelevata mediato su un determinato intervallo di tempo.
8. Contatore di gas per la determinazione del consumo di una miscela di gas, dove il contatore di gas presenta un anemometro (2) per la determinazione di una portata di massa di gas nonché un circuito elettronico di valutazione, dove il contatore di gas è tarato come apparecchio per la misura dell'energia, dove per una calibrazione diretta del contatore di gas come apparecchio per la misura di energia o di potenza vengono determinati dei valori di segnale di sensore (Sn) di un gas di taratura in funzione della portata del gas di taratura e vengono memorizzati nella forma di una curva di taratura del sensore (Fn(Sn)) come portata in funzione di un segnale di sensore (S) nel contatore di gas, la curva di taratura del sensore (Fn(Sn)) viene moltiplicata per un fattore di ricalcolo del segnale (fN2-CH) e per un fattore di potere calorifico (HCH) che tiene conto del potere calorifico per unità della grandezza di portata per una miscela di gas di base (CH), e il prodotto ottenuto indica una potenza (P) o un valore di consumo di energia (E), dove il fattore di ricalcolo del segnale (fN2-CH) tiene conto della differenza di sensibilità dell'anemometro (2) nel caso dell'utilizzo della miscela di gas di base al posto del gas di taratura, il contatore di gas presenta dei mezzi di correzione allo scopo di moltiplicare un valore di consumo di energia misurato per un fattore di correzione ( /HCH) che tiene conto almeno approssimativamente del potere calorifico ( ) di una miscela di gas prelevata, e che il mezzo di misura (2) è un anemometro a CMOS, caratterizzato dal fatto che il gas di taratura è scelto dal gruppo costituito da N2 o aria. |
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