 Member since Mar '08
Working languages: English to Greek
Greek to English
Availability today:  | February 2012 |  | | S | M | T | W | T | F | S | | | | | 1 | 2 | 3 | 4 | | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | | 26 | 27 | 28 | 29 | | | | |
|    Dimitris Mantas
MSc in Translation | Medical & Technical
Athens, Attiki, Greece Local time: 22:58 EET (GMT+2)
Native in: Greek  | |
Medical, Technical, IT ... Professional Freelance Translator | Freelancer,  Verified member | | Translation, Editing/proofreading, Website localization, Software localization, Subtitling, Transcription, Desktop publishing | | Specializes in: | | Medical: Cardiology | Medical: Instruments | | Medical (general) | Computers (general) | | Medical: Pharmaceuticals | Chemistry; Chem Sci/Eng | | Science (general) | Computers: Hardware | | Automotive / Cars & Trucks | Finance (general) |
| Also works in: | | Petroleum Eng/Sci | IT (Information Technology) | | Engineering (general) | Computers: Systems, Networks | | Physics | Energy / Power Generation | | Electronics / Elect Eng | Business/Commerce (general) | | Patents | Construction / Civil Engineering | | Computers: Software | Biology (-tech,-chem,micro-) | | Cosmetics, Beauty | Government / Politics | | Marketing / Market Research | Media / Multimedia | | Telecom(munications) | Medical: Dentistry | | Medical: Health Care | Mechanics / Mech Engineering | | Tourism & Travel | Surveying | | Printing & Publishing | Management | | Transport / Transportation / Shipping | Internet, e-Commerce | | Genetics | Cinema, Film, TV, Drama | | Accounting | Economics |
More Less | | EUR | | PRO-level points: 120, Questions answered: 47 | | Wire transfer, Money order | Sample translations submitted: 2 | English to Greek: Broad Peaks, Do your peaks need to go on a diet? | Source text - English
Broad Peaks
John W. Dolan, BASi Northwest Laboratory, McMinnville, Oregon, USA.
Do your peaks need to go on a diet?
Peaks that are too broad can mean that analysts are not using their liquid chromatography (LC) columns very
efficiently. Narrow peaks can translate into faster runs, because less time is necessary to obtain baseline separation. This month’s “LC Troubleshooting” takes a look at how to determine if peaks are broader than they should be and discusses some of the most common system-related causes of peak broadening. For this discussion, I’ll focus on reversed-phase isocratic separations.
What Is Fat?
As we all know from our interactions with others or examinations of ourselves in a mirror, classifying a person as being overweight involves opinion more than quantification in most instances. What constitutes an LC peak that is too broad also involves a certain amount of opinion. However, some simple quantitative measures of peak performance generally serve better than a simple visual
examination of the chromatogram to determine if a peak is too broad.
The peak width is a poor measurement of a chromatographic peak, because the peak width increases proportionally with the retention time (tR) for isocratic - separations. The first step in quantifying the broadness of a peak should be to measure the plate number (N) for the peak of interest. The plate number can be measured in one of two ways:-,
N = 5.54 (tR/w0.5)2 [1]
or
N = 16 (tR/w)2 [2]
where w0.5 and w are the peak width measured at half the peak height and at the baseline between tangents drawn to the sides of the peak, respectively. I preferthe half-height method because it is easier, especially if two adjacent peaks are not baseline resolved. Most data systems should be able to determine N using either method.
The literature that comes with a column typically reports plate numbers of approximately 80000/m for 5 µm dp media
and 100000/m for 3 µm dp media. Do not look for this kind of performance with your method, though. The manufacturers test columns under very carefully controlled conditions with test compounds such as toluene and methyl benzoate, which provide ideal chromatographic behaviour. A method for analysis of a pharmaceutical compound in plasma, a pesticide in hog fat or a synthetic intermediate will not behave in such an ideal manner. As a guide for reasonable chromatographic performance with a real compound, I use the following estimate: "A4
N ≈ 3000 L/dp [3]
where L is the column length in - centimetres and dp is the packing particle -1 diameter in micrometres. If I observe plate numbers within approximately 20% of this estimate, I don’t worry much about column performance. A 15 cm long, 5 µm dp C18 column probably won’t generate more than approximately 9000 plates, even though its manufacturer might report N values of approximately 12000.
Is Tailing a Problem?
Another measurement that I make before drawing any conclusions about excessive peak broadening is the amount of peak
tailing. The two most common measures of peak tailing are the USP (US Pharmacopeia) tailing factor (Tf) and the peak asymmetry factor (As). Tf is calculated as the ratio of the peak width to twice the front half-width of the peak as measured at 5% of the peak height — as is the back
half-width divided by the front half-width of the peak measured at 10% of its height. Generally, the tailing factor is used in the pharmaceutical industry, and the
asymmetry factor for other applications; it doesn’t really matter from a technical standpoint which method you use, as long as you consistently use the same method.
Once again, the column manufacturer’s test compounds and real samples are different. The test compounds exhibit little, if any tailing, whereas it is rare to have a perfectly symmetric peak with a real sample. As long as the tailing factor or the asymmetry factor is no more than approximately 1.5, it is generally not worth trying to improve. Larger values of peak tailing could mean that unwanted
secondary interactions are occurring. Techniques to reduce peak tailing have been discussed in previous “LC Troubleshooting” columns (e.g., see reference 1).
Extracolumn Effects
Let’s assume that peak tailing is acceptable. You obtained a plate number for a peak that was less than approximately 80% of the value estimated from Equation 3. If all the peaks in the chromatogram are well separated, it might still not be worth addressing the problem. If resolution has suffered or if you would like to improve
LC Troubleshooting
resolution so that you can speed the separation by obtaining the same
resolution in less time, then it is time to look more closely at the chromatogram. Measure the plate number for peaks eluted at the beginning, middle and end of the chromatogram. If the plate number
improves with retention time, extracolumn effects are a likely problem source. Extracolumn effects are reflected in the peak volume:
2 2 2 2
Vtot = Vcol + Vinj + Vtub +
2 2 Vfit + Vdet
where V2 is the square of the peak volume (in millilitres) and the subscripts indicate the contributions from the column, the injector, the tubing, the fittings and the detector. The total peak volume is the square root of the sum of the volumetric peak variances of the various components of Equation 4. The contributions from the injector, tubing, fittings and detector (and sometimes a term is added for the time constant or data rate) are called extracolumn effects, because they are factors outside the column.
Consider two scenarios: First, the volume contribution of the column is large compared with the extracolumn contributions. In this instance, the percentage contribution to
the overall peak volume by the
extracolumn effects is small and can usually be ignored. Second, the extracolumn effects are much larger and are significant when compared with the contributions by the column. So, narrower peaks are more strongly affected by extracolumn effects than broader peaks. In an isocratic chromatogram, the earlier-eluted peaks are narrower than later-eluted ones (Figure 1). It follows that extracolumn effects negatively influence peaks with smaller retention times more than they do those - with larger retention times. If you observed more broadening (smaller values of N) earlier in the chromatogram, extracolumn effects could be responsible.
routine LC–UV work generates relatively large peak volumes, and, unless you are quite sloppy with the system plumbing, it is unlikely that you will notice extracolumn contributions from the tubing, fittings or detector. If you are suspicious, make sure to minimize excess tube lengths and keep the tubing diameter no larger than 0.007
in. i.d.
Contrast this column with the 50 x 2.1 mm 3 µm dp column that generates peaks less than one-tenth the volume of the larger column. A tube end that is poorly seated in a fitting or the accidental use of a piece of 0.010 in i.d. tubing can dramatically increase the peak width.
If you aren’t convinced, make some trial calculations using Equation 4 and add 10 µL of extracolumn volume to the column-generated peak volumes shown in Table 1. The small peak volumes generated by 2.1 and 1.0 mm i.d. columns are good examples of why it is difficult to obtain column plate numbers that are close to those reported by the manufacturer with test compounds. It is easy to see how chromatographers can get comfortable using 150 x 4.6 mm columns for routine work and get into trouble by switching to 50 X 2.1 mm columns, unless they take care to minimize the extracolumn contributions from the tubing, fittings and detector.
What about the Injector?
The sample injection process can contribute to peak broadening in two different ways: First, if too large a sample volume is injected, it can cause increased peak widths. Second, if the injection - solvent is stronger than the mobile phase, it can wash some of the sample molecules down the column until the solvent is diluted by the mobile phase.
For the first injection-related contribution to band spreading, think of an extreme instance in which the sample volume is the same as the column volume and in which the mobile phase is used as the injection solvent. The first sample molecules injected would migrate a significant distance down
the column before the last of the sample molecules were injected. This situation would generate an extremely broad band. The opposite would be an infinitely small injection size in which all sample molecules reach the column simultaneously. Realistic injection sizes are somewhere between these two extremes.
How much sample can be injected without deleterious peak broadening? If a 5% loss in resolution is acceptable, approximately 15% of the peak volume of the first peak of interest can be injected, if the mobile phase is used as the injection solvent. Table 1 shows that this percentage would allow approximately 20 µL for the 150 x 4.6 mm column, but only 2 µL for the 50 x 2.1 mm column. Many of the LC–tandem mass spectrometry (MS–MS) methods in my laboratory that use 50 x 2.1 mm columns also call for 5–10 µL injections. Extra band spreading caused by this peak volume is expected, but typical chromatograms have only two well-resolved peaks; the additional selectivity of the mass spectrometer enables users to obtain acceptable quantitative results.
The second injection-related contribution to band spreading is the injection solvent. When a strong injection solvent washes some of the sample molecules down the column and dilutes the sample in the mobile phase, this process smears the injection along the top of the column and causes band broadening and sometimes tailing, distortion or splitting of all the peaks in the chromatogram (see the discussion in reference 2 for an example). Again, the injection volume and injection solvent strength must be balanced. For
Figure 1: Isocratic chromatogram showing broadening of later peaks.
Column Size
An additional parameter that plays a very important role in the influence of extracolumn effects is the column size. Just as the peak volume drops with smaller retention times, so do smaller volume columns generate smaller peak volumes. Refer to Table 1 to see this influence. I’ve calculated peak volumes based upon Equation 3 for peaks with retention factors (k) of 1 and 5 for three column configurations. The 150 x 4.6 mm, 5 µm dp column that most of us use for
LC Troubleshooting
example, a 5 µL injection of sample in a strong-solvent mobile phase is unlikely to cause much problem with a 150 x 4.6 mm column, but a 20 µL injection might. The best advice here is to determine the effect empirically. When the injection solvent is stronger than the mobile phase, double and halve the injection volume and see if it has any practical effect on the separation and then you can decide if modification of the method is necessary.
However, if the injection solvent is weaker than the mobile phase, you can usually inject much more than the 15% guideline. This larger injection volume is possible because the migration of peaks in the injection solvent is slower than in the mobile phase, and it has the effect of compressing the peak at the top of the column during injection. This technique of on-column concentration can be a handy tool to enable the injection of a problematic sample.
I remember a method in which the chromatographer needed to inject 50 µL of sample that was extracted into methanol, but the mobile phase was 50% methanol. By diluting the sample fourfold with water, it was possible to inject the same sample mass in 200 µL and avoid the horrible peak broadening encountered when 50 µL of 100% methanol was used as the injection solvent. Again, an empirical test should help guide you towards a suitable injection volume in a weak solvent.
And Finally, the Data System
I mentioned that sometimes Equation 4 is written to include a band-spreading term caused by the data system. If the data rate is too slow, an insufficient number of data points would be gathered, and peak broadening could appear. The general rule is that 10-20 data points should be gathered across the peak. If the 150 x 4.6 mm column of Table 1 was operated at 1 ~a mL/min, the first peak would be approximately 0.125 min or approximately
7 s wide. A data rate of 2 Hz or more should be sufficient for this instance. The
50 x 2.1 mm, 3 µm dp column would use a flow-rate of 0.2 mL/min for the same linear velocity and would generate a peak approximately 3 s wide. To obtain
10-20 data points across this peak, the data rate would have to be 4 Hz or more.
Conclusions
I've considered only a few of the sources of band broadening in this "LC Troubleshooting" column, but these variables are ones that can influence peak broadening in any
separation. Control these variables and you can feel fairly confident that you are not doing anything stupid that causes unwanted peak broadening.
Another easily controlled source of band broadening is column temperature. If the column temperature is constant, both axially and radially, you shouldn't have unwanted temperature-related peak distortion. Use a column oven and make sure the solvent at the inlet to the column is within 65 °C of the column temperature, and you should be safe. (Reference 3 has a case study of extracolumn and temperature effects.)
If you still observe excessively broad peaks after these sources are eliminated, look to chemical interactions such as excessive interactions with surface silanol groups, slow diffusion (especially a problem with high molecular weight samples) or some other sample-related source.
| Translation - Greek
Ευρείες Κορυφές
John W. Dolan, Εργαστήριο BASi Northwest, McMinnville, Oregon, ΗΠΑ.
Μήπως οι κορυφές σας χρειάζονται δίαιτα;
Οι υπερβολικά ευρείες κορυφές μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι οι αναλυτές δεν χρησιμοποιούν με τον πλέον αποτελεσματικό τρόπο τις στήλες υγρής χρωματογραφίας (LC). Οι στενές κορυφές μεταφράζονται σε ταχύτερη διαδικασία λήψης, καθώς απαιτείται λιγότερος χρόνος για να επιτευχθεί ο διαχωρισμός της γραμμής βάσης. Το “LC Troubleshooting” αυτού του μήνα ασχολείται με τον τρόπο προσδιορισμού των κορυφών που είναι ευρύτερες από όσο πρέπει και αναλύει μερικές από τις πλέον συχνές, σχετιζόμενες με το σύστημα αιτίες του εν λόγω φαινομένου. Στα πλαίσια της παρούσας ανάλυσης, θα εστιάσω στους ισοκρατικούς διαχωρισμούς αντίστροφης φάσης.
Τι σημαίνει Υπέρβαρος;
Όπως όλοι γνωρίζουμε από την αλληλεπίδρασή μας με άλλους ή από την όψη μας στον καθρέπτη, ο χαρακτηρισμός ενός ατόμου ως υπέρβαρο βασίζεται, στις περισσότερες των περιπτώσεων, πιο πολύ στην προσωπική γνώμη παρά στην ποσοτική ανάλυση. Ο χαρακτηρισμός μιας κορυφής LC ως υπερβολικά ευρείας επίσης ενέχει ένα σημαντικό ποσοστό προσωπικής γνώμης. Ωστόσο, μερικά απλά ποσοτικά μέτρα απόδοσης των κορυφών συχνά αποδεικνύονται χρησιμότερα σε σύγκριση με την απλή οπτική εξέταση του χρωματογραφήματος, αναφορικά με τον προσδιορισμό της υπερβολικής ευρύτητας ή μη μιας κορυφής.
Το πλάτος της κορυφής είναι ένα πτωχό μέτρο αξιολόγησης μιας χρωματογραφικής κορυφής, καθώς το πλάτος των κορυφών αυξάνεται αναλογικά με τον χρόνο κατακράτησης (tR) στους ισοκρατικούς διαχωρισμούς. Το πρώτο βήμα στη διαδικασία ποσοτικού προσδιορισμού της ευρύτητας μιας κορυφής θα πρέπει να είναι η μέτρηση του αριθμού πλακών (N) για την κορυφή ενδιαφέροντος. Ο εν λόγω αριθμός μετράται με έναν από τους δύο παρακάτω τρόπους:
N = 5,54 (tR/w0,5)2 [1]
ή
N = 16 (tR/w)2 [2]
όπου w0,5 και w είναι το πλάτος της κορυφής που έχει μετρηθεί στο μισό του ύψους της κορυφής και στη γραμμή βάσης, ανάμεσα σε εφαπτόμενες που έχουν χαραχθεί στις πλευρές της κορυφής, αντίστοιχα. Προσωπικά προτιμώ τη μέθοδο του "μισού ύψους" καθώς είναι ευκολότερη, ειδικά στις περιπτώσεις όπου δύο γειτονικές κορυφές δεν σχετίζονται σε ό,τι αφορά τη γραμμή βάσης. Τα περισσότερα συστήματα δεδομένων θα πρέπει να είναι σε θέση να προσδιορίσουν το N χρησιμοποιώντας οιαδήποτε εκ των δύο μεθόδων.
Στο έντυπο υλικό που συνοδεύει μια στήλη συνήθως αναφέρονται αριθμοί πλακών της τάξης των 80000/m για μέσα 5 µm dp και 100000/m για μέσα 3 µm dp.
...ο χαρακτηρισμός ενός ατόμου ως υπέρβαρο βασίζεται, στις περισσότερες των περιπτώσεων, πιο πολύ σε προσωπική γνώμη παρά σε ποσοτική ανάλυση. Ο χαρακτηρισμός μιας κορυφής LC ως υπερβολικά ευρείας επίσης ενέχει ένα σημαντικό ποσοστό προσωπικής γνώμης.
Δεν θα πρέπει, ωστόσο, να αναμένετε μια τέτοια απόδοση με τη μέθοδό σας. Οι κατασκευαστές δοκιμάζουν τις στήλες τους υπό εξαιρετικά προσεκτικά ελεγχόμενες συνθήκες, με δοκιμαστικά σύμπλοκα όπως το τολουένιο και το βενζοϊκό μεθύλιο, τα οποία παρουσιάζουν ιδανική χρωματογραφική συμπεριφορά. Μια μέθοδος για την ανάλυση ενός φαρμακευτικού συμπλόκου στο πλάσμα, ενός παρασιτοκτόνου στο λίπος ενός χοίρου ή ενός συνθετικού ενδιάμεσου προϊόντος, δεν θα λειτουργήσει με τον ίδιο ιδανικό τρόπο. Χρησιμοποιώ τον παρακάτω υπολογισμό ως οδηγό για τον προσδιορισμό της λογικά αναμενόμενης χρωματογραφικής συμπεριφοράς με πραγματικό σύμπλοκο:
N ≈ 3000 L/dp [3]
όπου L είναι το μήκος της στήλης σε εκατοστά και dp είναι η διάμετρος του μορίου που πληρώνει τη στήλη σε μικρόμετρα. Εάν παρατηρήσω αριθμούς πλακών στο 20%, κατά προσέγγιση, αυτού του υπολογισμού, δεν ανησυχώ και τόσο πολύ για την απόδοση της στήλης. Μια στήλη C18 μήκους 15 cm με 5 µm dp, πιθανόν να μην παράξει περισσότερες από 9000 πλάκες, παρόλο που ο κατασκευαστής της αναφέρει τιμές N της τάξης των 12000.
Η ανάπτυξη "ουράς" αποτελεί πρόβλημα;
Μία άλλη μέτρηση που παίρνω πριν καταλήξω σε συμπέρασμα αναφορικά με την υπερβολική ευρύτητα μιας κορυφής είναι το ποσοστό ανάπτυξης ουράς στην κορυφή. Τα δύο πλέον συνήθη μέτρα αξιολόγησης της ουράς των κορυφών είναι ο παράγοντας ανάπτυξης ουράς USP (US Pharmacopeia) (Tf) και ο παράγοντας ασυμμετρίας κορυφής (As). Ο Tf υπολογίζεται ως η αναλογία του πλάτους της κορυφής προς το διπλάσιο του πρόσθιου ημιπλάτους της κορυφής, όπως μετράται στο 5% του ύψους της - ως είναι το οπίσθιο ημιπλάτος διαιρεθέν με το πρόσθιο ημιπλάτος της κορυφής, το οποίο έχει μετρηθεί στο 10% του ύψους της. Γενικά, ο παράγοντας ανάπτυξης ουράς χρησιμοποιείται στην φαρμακοβιομηχανία και ο παράγοντας ασυμμετρίας σε άλλες εφαρμογές. Από τεχνικής άποψης δεν έχει ιδιαίτερη σημασία ποια μέθοδο θα χρησιμοποιήσετε, με την προϋπόθεση ότι θα εφαρμόζετε με συνέπεια την ίδια μέθοδο.
Επαναλαμβάνω ότι τα δοκιμαστικά σύμπλοκα του κατασκευαστή και τα πραγματικά δείγματα διαφέρουν κατά πολύ. Τα δοκιμαστικά σύμπλοκα εμφανίζουν μικρή, ή και μηδαμινή, τάση ανάπτυξης ουράς, ενώ με ένα πραγματικό δείγμα σπάνια έχουμε μια απόλυτα συμμετρική κορυφή. Από τη στιγμή που ο παράγοντας ανάπτυξης ουράς ή ασυμμετρίας δεν υπερβαίνει το 1,5, δεν έχει νόημα καμία προσπάθεια βελτίωσης των συνθηκών. Οι μεγαλύτερες τιμές στον παράγοντα ανάπτυξης ουράς θα μπορούσαν να σημαίνουν την παρουσία ανεπιθύμητων δευτερευουσών αλληλεπιδράσεων. Τεχνικές για την ελάττωση του σχηματισμού ουράς κορυφών έχουν αναλυθεί σε προηγούμενα άρθα του “LC Troubleshooting” (π.χ. βλέπε Αναφορά 1).
Επιδράσεις εκτός στήλης
Ας υποθέσουμε ότι η ανάπτυξη ουράς της κορυφής είναι σε αποδεκτά πλαίσια. Έχετε επιτύχει αριθμό πλακών για μια κορυφή σε επίπεδο κάτω του 80% της τιμής που υπολογίζεται από την Εξίσωση 3. Εάν όλες οι κορυφές του χρωματογραφήματος είναι καλά διαχωρισμένες, ενδέχεται να μην αξίζει και πάλι να αντιμετωπίσετε το πρόβλημα. Εάν η ανάλυση έχει χειροτερεύσει ή εάν επιθυμείτε να βελτιώσετε την ανάλυση με σκοπό την επιτάχυνση του διαχωρισμού, επιτυγχάνοντας την ίδια ανάλυση σε λιγότερο χρόνο, τότε είναι καιρός να εξετάσετε πιο προσεκτικά το χρωματογράφημα. Μετρήστε τον αριθμό πλακών για τις κορυφές που εκλούονται κατά την αρχή, τη μέση και στο τέλος του χρωματογραφήματος. Εάν ο αριθμός πλακών βελτιώνεται με την πάροδο του χρόνου κατακράτησης, τότε η πιθανή πηγή του προβλήματος είναι οι επιδράσεις εκτός στήλης.
Οι επιδράσεις εκτός στήλης αντικατοπτρίζονται στον όγκο της κορυφής:
όπου V2 είναι ο όγκος της κορυφής εις το τετράγωνο (σε χιλιοστόλιτρα) και οι δείκτες υποδεικνύουν τη συνεισφορά της στήλης, του εγχυτήρα, των σωλήνων, των συνδέσμων και του ανιχνευτή. Ο συνολικός όγκος κορυφής είναι η τετραγωνική ρίζα του αθροίσματος των ογκομετρικών διακυμάνσεων των κορυφών των διαφόρων τμημάτων της Εξίσωσης 4. Οι συνεισφορές της στήλης, του εγχυτήρα, των σωλήνων, των συνδέσμων και του ανιχνευτή (ορισμένες φορές προστίθεται όρος για τη σταθερά χρόνου ή το ρυθμό λήψης δεδομένων) καλούνται επιδράσεις εκτός στήλης, καθώς αποτελούν παράγοντες επίδρασης εκτός συστήματος.
Αναλογιστείτε δύο σενάρια: Πρώτον, η συνεισφορά της στήλης στον όγκο είναι μεγάλη σε σύγκριση με τις επιδράσεις εκτός στήλης. Σε αυτή την περίπτωση, η ποσοστιαία συνεισφορά στο συνολικό όγκο της κορυφής από τις επιδράσεις εκτός στήλης είναι μικρή και συνήθως αμελητέα. Δεύτερον, οι επιδράσεις εκτός στήλης είναι μεγαλύτερες και σημαντικές, σε σύγκριση με τη συνεισφορά της στήλης. Επομένως, οι στενότερες κορυφές επηρεάζονται σε μεγαλύτερο βαθμό από τις επιδράσεις εκτός στήλης σε σύγκριση με τις ευρύτερες κορυφές. Σε ένα ισοκρατικό χρωματογράφημα, οι κορυφές που εκλούονται πρώτες είναι στενότερες σε σχέση με τις μεταγενέστερες (Σχήμα 1). Συνεπώς, οι επιδράσεις εκτός στήλης επηρεάζουν αρνητικά τις κορυφές με μικρότερους χρόνους κατακράτησης περισσότερο από όσο επηρεάζουν αυτές με μεγαλύτερους χρόνους κατακράτησης. Εάν παρατηρήσετε ευρύτερες κορυφές (μικρότερες τιμές N) νωρίτερα στην πορεία λήψης του χρωματογραφήματος, ένας πιθανός υπαίτιος είναι οι επιδράσεις εκτός στήλης.
Μέγεθος Στήλης
Μία πρόσθετη παράμετρος που παίζει έναν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στον αντίκτυπο των επιδράσεων εκτός στήλης είναι το μέγεθος της στήλης. Ακριβώς όπως ο όγκος των κορυφών μειώνεται με τους μικρότερους χρόνους κατακράτησης, έτσι και οι στήλες μικρότερου όγκου παράγουν κορυφές μικρότερου όγκου. Ανατρέξτε στον Πίνακα 1 για την περιγραφή της εν λόγω επίδρασης. Έχω υπολογίσει τους όγκους κορυφών με βάση την Εξίσωση 3 για κορυφές με παράγοντες κατακράτησης (k) 1 και 5, σε τρεις διαφορετικές ρυθμίσεις στήλης. Η στήλη των 150 x 4,6 mm, 5 µm dp, που χρησιμοποιούμε οι περισσότεροι από εμάς για εργασίες LC–UV ρουτίνας, παράγει σχετικά μεγάλους όγκους κορυφών, και, εκτός αν δεν χειρίζεστε με ιδιαίτερη δεξιοτεχνία τις σωληνώσεις του συστήματος, είναι σχετικά απίθανο να συναντήσετε επιδράσεις εκτός στήλης από τους σωλήνες, τους συνδέσμους ή τον ανιχνευτή. Εάν έχετε αμφιβολίες, μην αμελήσετε να ελαχιστοποιήσετε το περίσσιο μήκος των σωληνώσεων και να διατηρήσετε τη διάμετρο των σωλήνων μικρότερη από 0,007 σε i.d. Θα πρέπει να αντιπαραβάλλετε την εν λόγω στήλη με τη στήλη των 50 x 2,1 mm 3 µm dp που παράγει όγκους μικρότερους από το ένα δέκατο των όγκων της μεγαλύτερης στήλης. Μια απόληξη σωλήνα που δεν έχει τοποθετηθεί σωστά στο σύνδεσμο ή η κατά λάθος χρήση ενός σωλήνα 0,010 σε i.d., μπορούν να αυξήσουν δραματικά το πλάτος της κορυφής.
Εάν δεν έχετε πειστεί, κάντε κάποιους δοκιμαστικούς υπολογισμούς χρησιμοποιώντας την Εξίσωση 4 και προσθέστε 10 µL "εκτός στήλης" όγκου στους παραγόμενους από τη στήλη όγκους που εμφανίζονται στον Πίνακα 1. Οι μικροί όγκοι κορυφών που παράγονται από τις στήλες των 2,1 και 1,0 mm i.d. αποτελούν μια καλή απόδειξη του πόσο δύσκολο είναι να επιτευχθούν αριθμοί πλακών που προσεγγίζουν τις αναφερόμενες από τους κατασκευαστές, με δοκιμαστικά σύμπλοκα. Εύκολα παρατηρεί κανείς ότι οι αναλυτές δύνανται να λειτουργήσουν άνετα με στήλες 150 x 4,6 mm για εργασίες ρουτίνας, ενώ "τα βρίσκουν σκούρα" με τις στήλες των 50 Χ 2,1 mm, εκτός κι αν φροντίσουν να ελαχιστοποιήσουν τις επιδράσεις εκτός στήλης από τις σωληνώσεις, τους συνδέσμους και τον ανιχνευτή.
Τι συμβαίνει με τον Εγχυτήρα;
Η διαδικασία έγχυσης του δείγματος δύναται να συνεισφέρει στη διεύρυνση της κορυφής με δύο διαφορετικούς τρόπους: Πρώτον, εάν εγχυθεί υπερβολικά μεγάλος όγκος δείγματος, το αποτέλεσμα ενδέχεται να είναι αυξημένα πλάτη κορυφών. Δεύτερον, εάν ο διαλύτης-έγχυσης είναι ισχυρότερος από την κινητή φάση, μπορεί να εκπλύνει κάποια από τα μόρια του δείγματος και να τα παρασύρει στο κάτω μέρος της στήλης έως ότου ο διαλύτης αραιωθεί από την κινητή φάση.
Αναφορικά με την πρώτη σχετιζόμενη με την έγχυση διεύρυνση ζώνης (band spreading), αναλογιστείτε την ακραία περίπτωση κατά την οποία ο όγκος του δείγματος είναι ο ίδιος με τον όγκο της στήλης και στην οποία η κινητή φάση χρησιμοποιείται ως διαλύτης έγχυσης. Τα πρώτα μόρια του δείγματος θα έχουν μεταφερθεί σε μεγάλη απόσταση προς το κάτω μέρος της στήλης πριν ακόμα εγχυθούν τα τελευταία μόρια του δείγματος. Η εν λόγω κατάσταση θα είχε ως αποτέλεσμα εξαιρετικά ευρεία ζώνη. Η αντίθετη περίπτωση συνίσταται στην έγχυση κατά πολύ μικρότερου όγκου, κατά την οποία όλα τα μόρια του δείγματος προσεγγίζουν ταυτόχρονα τη στήλη.
Οι ρεαλιστικές ποσότητες έγχυσης βρίσκονται κάπου στο μέσον των δύο αυτών ακραίων καταστάσεων.
Πόσο δείγμα μπορεί να εγχυθεί χωρίς να παρατηρηθεί φθοροποιός διεύρυνση των κορυφών; Εάν μια απώλεια της τάξης του 5% στην ανάλυση είναι αποδεκτή, δύναται να εγχυθεί περίπου το 15% του όγκου κορυφής της πρώτης κορυφής ενδιαφέροντος, εάν η κινητή φάση χρησιμοποιείται ως διαλύτης έγχυσης. Στον Πίνακα 1 αποτυπώνεται ότι αυτό το ποσοστό θα επέτρεπε κατά προσέγγιση 20 µL για τη στήλη των 150 x 4,6 mm, αλλά μόνο 2 µL για τη στήλη των 50 x 2,1 mm.
Πολλές εκ των μεθόδων LC–συζευγμένης φασματομετρίας μαζών (MS–MS) στο εργαστήριό μου, στις οποίες χρησιμοποιούνται στήλες 50 x 2,1 mm, απαιτούν επίσης έγχυση 5–10 µL. Η πρόσθετη διεύρυνση ζώνης που προκαλείται από αυτόν τον όγκο κορυφής είναι αναμενόμενη, αλλά τα συνήθη χρωματογραφήματα έχουν μόνο δύο καλά διαχωρισμένες κορυφές. Η πρόσθετη εκλεκτικότητα του φασματογράφου μάζας δίδει τη δυνατότητα στους χρήστες να λαμβάνουν αποδεκτά ποσοτικά αποτελέσματα.
Η δεύτερη σχετιζόμενη με την έγχυση συνεισφορά στη διεύρυνση ζώνης είναι ο διαλύτης έγχυσης. Στις περιπτώσεις όπου ένας ισχυρός διαλύτης έγχυσης παρασύρει κάποια από τα μόρια του δείγματος στο κάτω μέρος της στήλης και διαλύει το δείγμα στην κινητή φάση, αυτή η διαδικασία ρυπαίνει την έγχυση στην κορυφή της στήλης και προκαλεί διεύρυνση ζώνης και ορισμένες φορές ανάπτυξη ουράς, παραμόρφωση ή διάσπαση σε όλες τις κορυφές του χρωματογραφήματος (ως παράδειγμα δείτε την ανάλυση στην αναφορά 2). Επαναλαμβάνω ότι ο όγκος έγχυσης και η ισχύς του διαλύτη έγχυσης θα πρέπει να είναι ισορροπημένα.
Σχήμα 1: Ισοκρατικό χρωματογράφημα που αποτυπώνει τη διεύρυνση των μεταγενεστέρων κορυφών.
Για παράδειγμα, μια έγχυση 5 µL δείγματος σε κινητή φάση ισχυρού διαλύτη είναι σχετικά απίθανο να προκαλέσει μεγάλα προβλήματα με στήλη 150x4,6 mm, αλλά μια έγχυση της τάξης των 20 µL θα μπορούσε. Η καλύτερη συμβουλή στην παρούσα φάση είναι ο εμπειρικός προσδιορισμός της επίδρασης. Όταν ο διαλύτης έγχυσης είναι ισχυρότερος από την κινητή φάση, διπλασιάστε και υποδιπλασιάστε τον εγχυόμενο όγκο και παρατηρήστε εάν υπάρχει πρακτικό αποτέλεσμα στο διαχωρισμό, και μόνο τότε μπορείτε να αποφανθείτε εάν η τροποποίηση της μεθόδου είναι απαραίτητη.
Ωστόσο, εάν ο διαλύτης έγχυσης είναι λιγότερο ισχυρός από την κινητή φάση, μπορείτε κατά κανόνα να εγχύσετε περισσότερο από το 15% της σχετικής οδηγίας. Ο μεγαλύτερος όγκος έγχυσης είναι εφικτός καθώς ο διαχωρισμός των κορυφών στο διαλύτη έγχυσης είναι βραδύτερος σε σχέση με την κινητή φάση, και επιδρά έτσι ώστε να συμπιέζεται η κορυφή στο άνω μέρος της στήλης κατά τη διάρκεια της έγχυσης. Η εν λόγω τεχνική της εντός της στήλης συγκέντρωσης (on-column concentration) μπορεί να αποδειχθεί ένα χρήσιμο εργαλείο, με το οποίο θα καθίσταται δυνατή η έγχυση ενός προβληματικού δείγματος.
Θυμάμαι μια μέθοδο κατά την οποία ο αναλυτής έπρεπε να εγχύσει 50μL δείγματος, το οποίο είχε εκχυλιστεί σε μεθανόλη, αλλά η κινητή φάση ήταν κατά 50% μεθανόλη. Αραιώνοντας το δείγμα με τετραπλάσια ποσότητα ύδατος, ήταν εφικτή η έγχυση της ίδιας μάζας δείγματος σε 200 µL και η αποφυγή της απότομης διεύρυνσης των κορυφών που εμφανίστηκε όταν τα 50μL 100% μεθανόλης χρησιμοποιήθηκαν ως διαλύτης έγχυσης. Επαναλαμβάνω ότι μια εμπειρική δοκιμασία θα σας βοηθούσε να καταλήξετε στον κατάλληλο όγκο έγχυσης σε μη ισχυρό διαλύτη.
Και τέλος, το Σύστημα Δεδομένων
Όπως έχω προαναφέρει, ορισμένες φορές η Εξίσωση 4 αναγράφεται έτσι ώστε να περιλαμβάνει έναν όρο διεύρυνσης ζώνης (band-spreading), η οποία προκαλείται από το σύστημα δεδομένων. Εάν ο ρυθμός λήψης δεδομένων είναι πολύ χαμηλός, συγκεντρώνεται ανεπαρκής αριθμός σημείων δεδομένων και επομένως είναι πιθανή η διεύρυνση των κορυφών. Ο γενικός κανόνας είναι ότι θα πρέπει να συγκεντρωθούν 10-20 σημεία δεδομένων κατά μήκος της κορυφής. Εάν η στήλη των 150 x 4,6 mm του Πίνακα 1 λειτουργούσε στο 1 mL/min, η πρώτη κορυφή θα εμφανιζόταν σε περίπου 0,125 min ή με εύρος 7 s κατά προσέγγιση. Σε αυτή την περίπτωση, ένας ρυθμός λήψης δεδομένων της τάξης των 2 Hz ή περισσότερο, θα ήταν επαρκής. Η στήλη των 50 x 2,1 mm, 3 µm dp θα χρησιμοποιούσε ρυθμό ροής της τάξης των 0,2 mL/min για την ίδια γραμμική ταχύτητα και θα παρήγαγε κορυφή εύρους 3s κατά προσέγγιση. Για να ληφθούν 10-20 σημεία δεδομένων κατά μήκος αυτής της κορυφής, ο ρυθμός λήψης δεδομένων θα έπρεπε να είναι 4Hz ή περισσότερο.
Συμπεράσματα
Στην παρούσα στήλη "LC Troubleshooting" έλαβα υπ' όψιν μου μόνο μερικές από τις πηγές πρόκλησης διεύρυνσης ζώνης, αλλά οι συγκεκριμένες μεταβλητές είναι αυτές που μπορούν να επηρεάσουν τη διεύρυνση ζώνης σε οιονδήποτε διαχωρισμό. Εάν θέσετε υπό έλεγχο τις εν λόγω μεταβλητές θα είστε σίγουρος ότι δεν κάνετε κάτι “βλακώδες” που θα μπορούσε να προκαλέσει τη διεύρυνση των κορυφών.
Μια άλλη εύκολα ελεγχόμενη πηγή πρόκλησης της διεύρυνσης ζώνης είναι η θερμοκρασία της στήλης. Εάν η θερμοκρασία της στήλης είναι σταθερή, τόσο αξονικά όσο και ακτινικά, λογικά δεν θα σας παρουσιαστεί ανεπιθύμητη, σχετιζόμενη με τη θερμοκρασία, παραμόρφωση κορυφών. Χρησιμοποιήστε κλίβανο και βεβαιωθείτε ότι η θερμοκρασία του διαλύτη και του σημείου εισόδου στη στήλη δεν υπερβαίνει τους 65°C της θερμοκρασίας της στήλης, και θα είστε ασφαλείς. (Η Αναφορά 3 μελετά μια περίπτωση επιδράσεων εκτός στήλης και θερμοκρασίας.)
Εάν εξακολουθείτε να παρατηρείτε υπερβολικά ευρείες κορυφές κατόπιν της εξάλειψης αυτών των παραμέτρων, εστιάστε στις χημικές αλληλεπιδράσεις, όπως η υπερβολική αλληλεπίδραση με τις επιφανειακές ομάδες σιλανόλης, η αργή διάχυση (ένα πρόβλημα που αφορά ιδιαίτερα τα δείγματα μεγάλου μοριακού βάρους) ή κάποια άλλη σχετιζόμενη με το δείγμα παράμετρο.
| | English to Greek: Molecular therapies in b-thalassaemia | Source text - English
Molecular therapies in b-thalassaemia
Lynn Quek1 and Swee Lay Thein1,2
1Department of Haematological Medicine, King’s College Hospital, Denmark Hill, and 2Division of Gene and Cell Based Therapy, King’s College London School of Medicine, Denmark Hill, London, UK
Summary
The b-thalassaemias have a major global impact on health and mortality. Allogeneic haemopoietic stem cell transplantation is the only approach that may lead to a cure but this approach is not available to most patients. The mainstay treatment for the majority remains life-long blood transfusion in combination with a rigorous regime of iron chelation. Improved under¬standing of the pathophysiology and molecular basis of the disease has provided clues for more effective strategies that aim to correct the defect in b-globin chain synthesis at the primary level or redress the a/b-globin chain imbalance at the secondary level. Improved understanding of the molecular basis of the disease complications, such as iron overloading, has also provided clues for potential molecular targets at the tertiary level.
Keywords: fetal haemoglobin induction, gene and molecular therapy, b-thalassaemia.
The thalassaemias are the most common monogenic disorders in the world. Globally, it is estimated that there are 270 million carriers, of which 80 million are carriers for b-thalassaemia. Because of a selective advantage of heterozygotes against the severe forms of malaria, the frequencies of b-thalassaemia are particularly high in the malarial tropical and sub-tropical regions of Asia, Mediterranean, and the Middle East (Flint et al, 1998). The epidemiology of the disease, however, is changing. In the less developed countries, affected children are on the increase due to falling childhood mortality from improved nutrition and better infection control, while in the more developed countries, epidemiology of the disease has been affected by a fall in total birth rate and preventive programmes. Further, because of recent population migra¬tions, b-thalassaemia has become an important part of clinical practice in Northern Europe, including the UK, the US and Australasia (Weatherall &Clegg, 1996).
Correspondence: Professor Swee L. Thein, Department of Haematological Medicine, Division of Gene and Cell Based Therapy, King’s College London School of Medicine, Denmark Hill, London SE5 9PJ, UK. E-mail: sl.thein@kcl.ac.uk
Carriers (heterozygotes) of b-thalassaemia are clinically normal and largely unaware of their genetic condition. Inheritance of two copies of b-thalassaemia genes, one from each parent, usually results in life-threatening anaemia and transfusion-dependence for survival. Intermediate clinical forms of the disease exist as thalassaemia intermedia, which is characterised by moderately severe anaemia with the occasional need for blood transfusion. The mainstay of treatment for the severe forms (thalassaemia major) is blood transfusion and aggressive management of complications including life-long iron chelation therapy. The complications of iron overload, together with the sequelae of the anaemia and ineffective erythropoiesis, and the chelation therapy itself, are major causes of morbidity and mortality in the transfusion-dependent b-thalassaemias (Weatherall &Clegg, 2001).
Although, regular blood transfusions in combination with aggressive iron chelation have been remarkably effective in delaying the onset of iron-related organ failure and improving mortality, many patients continue to be affected by cardiac disease, delayed pubertal maturation, and develop endocrine failure (Borgna-Pignatti et al, 2004). Further, the commitment to this rigorous life-long treatment regime is onerous and an enormous imposition on quality of life. Hence, the continuing quest is for amolecular-based strategy, which, at best, will lead to a cure, and, at the very least, can ameliorate the anaemia in the severe transfusion-dependent b-thalassaemias.
The molecular pathophysiology of b-thalassaemia
One of the first obstacles to designing effective gene therapy in b-thalassaemia is the understanding of the organisation and regulation of the b-like globin genes. These occur in a cluster occupying an 80 kb region on the short arm of chromosome 11 (Grosveld et al, 1993). Expression of these genes is restricted to erythroid cells and is regulated throughout development, with the sequential expression of e (embryonic), Gc and Ac (fetal), d and b (adult) genes. The tissue- and developmental-specific expression of the individual globin genes is governed by direct physical interactions between the upstream b-globin locus control region (b-LCR) and the globin promoters mediated through binding of tissue-restric¬ted and ubiquitous transcription factors (Grosveld et al, 1998).
ª 2006 The Authors First published online 27 October 2006
The ~-LCR consists of five conserved DNase1 hypersensitive sites (HS), designated HS1–5, distributed between 6 and 18 kb upstream of the gene cluster. The region acts as an enhancer of ~-like globin gene expression and is essential for high-level expression of all the genes in the complex.
Sequential expression of different βΡ-like globins during development also requires gene silencing, a process which involves the binding of repressor proteins to ‘silencer’ regions upstream of the gene. A protein, designated BP1, derived from a nuclear extract of K562 cells has been shown to bind to DNA upstream of the βΡ-globin gene in a region having negative regulatory function (Berg et al, 1989). Architectural nuclear proteins, such as high mobility group Y-1, are thought to be involved in ‘bending’ DNA to facilitate BP1 binding (Chase et al, 1999). Therapies that inhibit BP1 binding could therefore lead to increased ~-globin expression.
~-thalassaemia occurs when there is a quantitative reduction of ~-globin chains that are usually structurally normal (Weatherall &Clegg, 2001). The defective ~-globin production is caused by mutations affecting different levels in the protein synthesis cascade. Deletions affecting the ~-globin gene are rare. The vast majority of the ~-thalassaemias are caused by point mutations (such as single base substitutions), minor insertions or deletions, which affect transcription, RNA processing, RNA translation, and RNA stability (Forget, 2001). ~-thalassaemias can also be caused by mutations affecting the interacting transcription factors (general, TF11H, and erythroid-specific, GATA1) (Viprakasit et al, 2001; Yu et al, 2002).
Functionally, the mutations can be classified as ~°, in which there is a complete absence of ~-globin production, and ~+thalassaemia, where ~-globin production is present but reduced. Less severe ~-thalassaemic alleles include ~++ and ~Silent reflecting the minimal deficit in âÑ-chain synthesis. Although, ~-thalassaemia is typically inherited as haploinsuf¬ficient Mendelian recessives, inheritance of the different ~°, ~+, âÑ++ and ~Silent alleles in different combinations of homozygous and compound heterozygous states, has given rise to a spectrum of disease severity within the ~-thalassaemia drome (Thein, 2004).
Close observation of the genotype/phenotype relationships confirms that the severity of disease correlates well with the degree of quantitative reduction in ~-globin production (Thein, 2005a). While βΡ-globin chain production is reduced, the synthesis of ~-globin continues as normal in ~-thalas¬saemia, resulting in the accumulation of excess unmatched ~- globin chains in the erythroid precursors. The free ~-globin chains are not able to form viable teramers; they precipitate in the erythroid precursors forming inclusion bodies causing damage to the RBC membrane and premature destruction of the erythroid precursors in the bone marrow (ineffective erythropoiesis) (Schrier, 2002). Thus, factors that reduce the degree of chain imbalance and magnitude of ~-chain excess, such as co-inheritance of ~-thalassaemia or an innate ability to increase fetal haemoglobin (HbF, ~2~2), will have an amelior¬ating effect on the disease (Fig 1).
The gradual elucidation of the pathophysiology of ~-tha¬lassaemia, aprocess that has involved more than 50 years of biochemical and biological studies, has led to the development of new strategies in attempts to cure or ameliorate the disease (Thein, 2005b). These potential targets for therapy can be divided into three categories (Table I):
1 primary targets, including the genetic defects which lie at the root of decreased ~-globin expression;
2 secondary targets, directed at improving ~/~-globin chain imbalance; and
3 tertiary targets, which are those directed at treating the complications of ~-thalassaemia.
Primary target –gene correction therapy in ~-thalassaemia
Targeting the primary causes of reduced ~-globin production involves several strategies including haemopoietic stem cell transplantation (HSCT), gene therapy using viral vectors and antisense mRNA.
HSCT
Haemopoietic stem cell transplantation is conceptually the simplest and the only approach so far, that may lead to a definitive cure for ~-thalassaemia. Patients who stand to derive most benefit from such treatment are those with early but severe transfusion-dependent disease and have few co-morbi¬dities. Even in the best conditions, i.e. transplantation from a leucocyte antigen (HLA)-identical family donor, this treatment is associated with a 5% mortality. These patients still have a high risk of going onto develop tissue damage with time, such as impaired growth, gonadal failure, and chronic graft-versus¬host disease (GVHD) (Gaziev & Lucarelli, 2003).
A study of 68 patients with ~-thalassaemia major (median age 15 years) who received stem cells from non-related, human HLA-matched donors with myeloablative conditioning repor¬ted that 20% of study patients died from transplant-related causes. 40% had grade II–IV GVHD, 18% had chronic GVHD, and 13% had primary or secondary graft failure. Disease-free survival (DFS) appears to correlate with the Pesaro risk classification, which consists of previous use of iron chelation and the presence of liver disease. DFS was 80% in low risk patients, falling to 54% in those considered high risk, high risk patients being those who had not received regular chelation, and who have both hepatomegaly and fibrosis (La Nasa et al, 2005). Full myeloablative conditioning regimens used with transplantation were invariably associated with higher trans¬plant-related mortality (TRM). Such regimens were thought necessary to eradicate the thalassaemic clones to prevent graft rejection or failure.
However, more recent evidence suggests that a cohort of patients who have stable mixed chimerisms express sufficient functional âÑ-globin to be transfusion-independent. Natural mutants have also provided evidence that partial expression of ~-globin may be sufficient to convert atransfusion-dependent anaemia to thalassaemia intermedia. In two case reports of somatic mosaicism of the ~-globin gene (Badens et al, 2002; Galanello et al, 2004), the probands had moderately severe thalassaemia intermedia, despite being constitutionally hetero¬zygous for a common ~° thalassaemia mutation and having a normal ~ genotype. Investigations revealed somatic deletions of chromosome 11p15 including the ~-globin complex, in trans to the thalassaemia mutation. The somatic deletions produced a mosaic of cells, 50%with one functioning ~-globin gene and 50% without any functioning âÑ-globin gene (because of deletion of chromosome 11p15). The sum total of the ~-globin gene product was about 25% less than clinically normal ~-thalassaemia trait.
Studies of children with âÑ-thalassaemia undergoing non¬myeloablative have shown mixed results. The rate of graft failure is higher in such transplants although TRM is expectedly significantly lower. A small study of seven patients, six with sickle-cell anaemia (SCA) and one with transfusion-dependent ~-thalassaemia reported initial engraftment and transfusion-independence for six of the patients. However, tapering of immunosuppression led to graft failure and reversion to recipient disease (Iannone et al, 2003). These results were in contrast to those reported by Andreani et al (2000), where 27 patients had persistent stable mixed chimerisms and were transfusion-independent. The survival advantage of non¬thalassaemic stem cells over thalassaemic ones would suggest that a few engrafted donor cells maybe sufficient to ameliorate the severe anaemia in thalassaemia major. This raises the realistic possibility of effective reduced intensity conditioning regimens for high-risk patients (Andreani et al, 2000).
An attempt to quantify the level of donor chimerism required for effective erythropoiesis was discussed by Roberts et al (2005), where a mathematical model based on ~-thalassaemic mice undergoing non-myeloablative HSCT predicted that over 80% donor erythroid stem cells are required for cure in a mixed chimaera (Roberts et al, 2005).
Even though the possibility of reducing TRM with such strategies seem promising, the major hindrance to the use of HSCT as a routine treatment for ~-thalassaemia major is the shortage of suitable donors. The use of related or non-related umbilical cord blood transplants has extended the donor pool, but cord blood transplantations have had limited success in the treatment of ~-thalassaemia because of the large numbers of transplanted cells that are required to sustain haematopoiesis (Locatelli et al, 2003; Fang et al, 2004). Umbilical cord blood maybe more successful if the stem cell pool is expanded ex vivo.
Gene therapy
The genetic correction of autologous haematopoietic stem cells (HSCs) overcomes the dual disadvantages of donor shortage and GVHD in allogeneic HSCT. The development of this type of effective gene correction therapy for ~-thalassaemia has proved to be more challenging than originally anticipated. Gene therapy in ~-thalassaemia has to meet these criteria:
1 safe and efficient viral/non-viral transfection;
2 erythroid lineage specificity; and
3 therapeutic levels of functional ~-globin expression.
Review
Early attempts using conventional oncoretroviral systems carrying the ~-globin gene and ‘core’ elements of the ~-LCR were unsuccessful because of vector instability, low titres, and variable, low expression of human ~-globin (Cone et al, 1987; Dzierzak et al, 1988; Novak et al, 1990; Plavec et al, 1993). Adeno-associated virus (AAV) vectors were tried, but due to size restraints, only LCR ‘core’ elements could be inserted, which failed to overcome positional variability of expression in murine models. These difficulties prompted the investigation of alternative erythroid–specific transcriptional elements, such as the HS-40 regulatory region from the ~-globin gene locus (Ren et al, 1996), ankyrin promoters (Sabatino et al, 2000), and mutant ~-globin promoters associated with hereditary persist¬ence of HbF (Fragkos et al, 2005). However, all attempts met with limited success.
May et al (2000) reported that a lentivirus (LV) vector carrying a large fragment of the human ~-globin gene, including a large segment of the LCR, could ameliorate the anaemia in ~-thalassaemic mice. Stable therapeutic levels of βΡ-globin expression could be achieved using this system. This finding soon paved the way for the development of other HIV-1 based lentiviral vectors in gene therapy for haemoglob¬inopathies, superseding the oncoretroviral systems. Unlike retrovirus, LV vectors have a distinct advantage for their ability to transduce non-dividing cells. Other attributes of LV vectors that make them highly suitable for gene therapy of the haemoglobinopathies include: relative genomic stability; self-inactivating (SIN) design that results in the removal of the viral LTR upon integration resulting in a safer vector; and their relatively large packaging capacity. Lentiviral vectors can stably hold larger DNA inserts without rearrangements, an attribute that allows the incorporation of larger LCR fragments and chromatin insulator elements to overcome the problem of positional effects, with the ability to sustain therapeutic levels of expression.
The pioneering study of Sadelain and colleagues used a LV vector called TSN9, which contained HS2, 3 and 4 of the LCR (around 3.2 kb) together with an extended human ~-globin gene. Transfected ~-thalassaemia intermedia mice showed sustained rises in haemoglobin of around 38 g/l (May et al, 2000). Imren et al (2002) achieved modest increases in haemoglobin of around 15 g/l with a LV vector carrying a 2.7 kb segment of the LCR and an antisickling ~-globin gene, ~T87Q in ~-thalassaemia intermedia mice. The decreased level of correction compared with the earlier study of May et al (2000) could be attributed to the smaller LCR segment used in the LV vector (Imren et al, 2002).
The transduction of ~-globin expressing SIN-LV vectors induced an average of 11 g/l increase in haemoglobin in intermedia phenotype mice, a strategy that would be useful in both ~-thalassaemia and in SCA. However, there was variable vector expression because of chromosomal position effects (Persons et al, 2003). Transduction of stem cells with another LV vector incorporating larger LCR segments of 3.2 kb and the ~-globin gene resulted in higher increases of HbF (17–33%)with a mean increase in haemoglobin concentration of 26 g/l in thalassaemia intermedia mice (Hanawa et al, 2004).
Most studies have used thalassaemia intermedia mice and not thalassaemia major mice, which do not survive fetal life. This is because the switch from embryonic to adult haemoglobin production in mice occurs at days 14–15 of gestation. In order to create thalassaemia major mice, lethally irradiated adult mice received transplants of fetal liver cells removed from thalas¬saemia major before fatality. Engrafted mice develop severe anaemia (c. 30 g/l) and die within 6–8 weeks of transplantation. Transplantation of liver cells transfected with TSN9 vector rescued the mice, the majority of which developed a thalas¬saemia intermedia phenotype instead (Rivella et al, 2003).
In all of these studies, variable vector expression was noted that was ascribed to chromosomal position effects. Malik and co-workers have addressed this issue by designing aSIN¬lentiviral vector containing the βΡ-globin gene/LCR, BG1, which is flanked by the chicken HS-4 insulator upon integration. Transduced CD34+ cells from the bone marrow of four patients with transfusion-dependent ~-thalassaemia showed high-level ~-globin expression and sustained, complete phenotypic correction in immuno-deficient mice (Puthenveetil et al, 2004). Preclinical studies using such third generation LV systems are underway and hold great promise for clinical trials on gene therapy for ~-thalassaemia and SCA.
Co-regulation of globin transgene expression and RNA interference
RNA interference (RNAi) is apost-transcriptional silencing mechanism that has therapeutic potential for abrogating expression of nuisance genes, such as viral genes and oncogenes, and endogenous mutant genes such as ~-globin alleles. To achieve its therapeutic potential, RNAi will require highly specific and lineage-restricted gene silencing. Samakoglu et al (2006) recently showed that it was feasible to combine trangene expression and RNAi in HSCs. They encoded promotorless small hairpin RNA (shRNA) into the intron of a recombinant ~-globin gene. They transduced LV recombinant ~-globin gene into CD34+ cells from patients with SCA and upon erythroid differentiation, expression of both the ~-globin transgene and the small interfering RNA (siRNA) was induced with concom¬itantreduction ofthe endogenous ~S transcripts. This technique has been used to correct SCA but should be applicable to the ~-thalassaemias, and as a general strategy for simultaneous addition of one function and deletion of another in the same cell.
Homologous recombination and therapeutic cloning
The safety of gene therapy has been questioned because of the risk of insertional oncogeneis, as was seen in two out of the 10 patients successfully treated with gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. These two patients developed acute lymphoblastic leukaemia that could be linked to the integration of the retroviral vectors in or near the LMO2
Review
oncogene (Hacein-Bey-Abina et al, 2003). Although, SIN lentiviral vectors, with or without insulator elements, should provide safe and effective treatment, some concerns about insertional oncogenesis persist. An alternative approach is to correct the mutation itself by homologous recombination with a piece of DNA that confers the normal sequences ex vivo, and then reinfuse these corrected stem cells. The feasibility of this approach was recently demonstrated by Chang et al (2006) in mice with SCA. Haematopoietic cells, derived from the corrected embryonic stem (ES) cells from the sickle mice, produced HbA as well as HbS. Similarly, Wu et al (2006) reported the use of homologous recombination in ES cells from mice rendered with SCA by the ‘knocking-in’ of human ~s (his). The human ~S gene in mouse ES cells was replaced by human ~A gene, and the corrected ES cells injected into mouse blastocysts. Mice derived from corrected ES cells had a hbA/hbS genotype and expressed human HbA. Their phenotype was similar to that of humans with sickle-cell trait. An advantage of this approach is that it avoids the risk of viral mutagenesis. These experiments offer proof of principle that gene therapy by homologous recombination in ex vivo ES cells is a possibility for the haemoglobinopathies.
The challenge now lies in the translation of these principles to patients, and several steps have to be surmounted before this becomes a therapeutic reality. Patient-specific ES cells will have to be derived by somatic cell nuclear transfer, followed by correction of the mutant gene. The corrected cells will then have to be differentiated into HSCs in vitro and transplanted into the patient.
Therapeutic antisense mRNA
About half of the ~-thalassaemia mutations are caused by aberrent RNA splicing. Studies from a decade ago have shown that antisense oligonucleotides targeted at aberrant splice sites can restore correct splicing in erythroleukaemic cell lines (Sierakowska et al, 1996). More recently, the use of so-called morpholino oligonucleotides has enabled high level correction of transcribed mutant ~-globin mRNA. These are oligonucle¬otides where the deoxyribose rings linked to nucleic acids by anionic phosphates have been substituted with morpholine rings that are linked with phosphorodiamidate groups, which are uncharged. This renders the oligonucleotides resistant to RNAses. Furthermore, morpholinos, unlike phosphorothioate siRNA, do not promote cleavage of the target mRNA by RNAse H. However the lack of anionic charge means that morpholinos cannot be introduced into cells using standard cationic lipid transfectants. Instead, they have to be either syringe injected into cultured cells, or by free uptake of oligonucleotides through prolonged exposure to cultured erythroid precursors, where they have been shown to achieve up to 80% correction in human erythroid cells with the splice site mutation IVS2–654 (Suwanmanee et al, 2002a).
This work has implications for the treatment of ~-thalas¬saemia/HbE, a compound heterozygous state common insouth east Asia, and a major cause of thalassaemia major in this part of the world (Weatherall &Clegg, 2001). The point mutation responsible for HbE is also thalassaemic, as it activates a cryptic splice site causing abnormal mRNA splicing, concurrently reducing the normal splicing that produces HbE. As HbE is quantitatively reduced, the compound heterozygous state with ~-thalassaemia results in clinically significant anaemia. Morpholino oligonucleotides have been shown to correct the aberrant splice site in a HeLa cell line carrying thalassaemia mutations ~E/IVS1–6. The repaired ~E-mRNA was stable and translated into full length ~E globin polypeptide (Suwanmanee et al, 2002b). However, the ability of erythroid precursor cells, modified ex vivo and re-infused, to express sufficiently high levels of functional âÑ-globin remains untested. To date there are no published studies of successful in vivo use of therapeutic antisense mRNA. | Translation - Greek
Μοριακές θεραπείες στην β-θαλασσαιμία
Lynn Quek1 και Swee Lay Thein1,2
1Τμήμα Αιματολογικής Ιατρικής, King’s College Hospital, Denmark Hill και 2Τμήμα Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας, King’s College London School of Medicine, Denmark Hill, Λονδίνο, Ην. Βασίλειο
Σύνοψη
Οι β-θαλασσαιμίες έχουν σημαντικό αντίκτυπο στην παγκόσμια υγεία και θνησιμότητα. Η αλλογενετική μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων είναι η μοναδική προσέγγιση που μπορεί να οδηγήσει σε ίαση, αλλά δεν είναι διαθέσιμη για την πλειοψηφία των ασθενών. Η συνήθης θεραπεία για την πλειοψηφία των περιστατικών παραμένει η εφ όρου ζωής μετάγγιση αίματος με εντατικό σχήμα αποσιδήρωσης. Η βελτίωση της κατανόησης της παθοφυσιολογίας και της μοριακής βάσης της νόσου έχει παράσχει ενδείξεις για την κατάρτιση αποτελεσματικότερων στρατηγικών, που έχουν ως στόχο τη διόρθωση των ατελειών στη σύνθεση της β-σφαιρινικής αλυσίδας σε πρωταρχικό επίπεδο ή την ανάσχεση της διατάραξης της ισορροπίας στις α/β-σφαιρινικές αλυσίδες σε δευτερεύον επίπεδο. Η βελτίωση της κατανόησης της μοριακής βάσης των επιπλοκών της νόσου, όπως η υπερφόρτωση σιδήρου, έχει επίσης συντελέσει στον προσδιορισμό δυνητικών μοριακών στόχων σε τριτεύον επίπεδο.
Λέξεις κλειδιά: επαγωγή εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, γονιδιακή και μοριακή θεραπεία, β-θαλασσαιμία.
Οι θαλασσαιμίες είναι οι περισσότερο συχνές μονογονικές διαταραχές στον κόσμο. Παγκοσμίως, υπολογίζεται ότι υπάρχουν 270 εκατομμύρια φορείς, από τους οποίους 80 εκατομμύρια είναι φορείς της β-θαλασσαιμίας. Εξαιτίας του εκλεκτικού πλεονεκτήματος των ετεροζυγωτών έναντι των σοβαρών μορφών ελονοσίας, η συχνότητα εκδήλωσης της β-θαλασσαιμίας είναι εξαιρετικά υψηλή στις τροπικές και υποτροπικές περιοχές της Ασίας, της Μεσογείου και της Μέσης Ανατολής (Flint et al, 1998). Η επιδημιολογία της νόσου, ωστόσο, μεταβάλλεται. Στις λιγότερο αναπτυγμένες χώρες, ο αριθμός των παιδιών που προσβάλλονται από τη νόσο αυξάνεται εξαιτίας της μειούμενης παιδικής θνησιμότητας που οφείλεται στη βελτίωση της διατροφής και τον καλύτερο έλεγχο των λοιμώξεων, ενώ στις περισσότερο ανεπτυγμένες χώρες, η επιδημιολογία της νόσου έχει επηρεαστεί από τη συνολική μείωση στα ποσοστά γεννήσεων και τα προληπτικά προγράμματα. Επιπλέον, εξαιτίας της πρόσφατης μετανάστευσης πληθυσμών, η β-θαλασσαιμία έχει καταστεί ένα σημαντικό τμήμα της κλινικής πρακτικής στη Βόρεια Ευρώπη, συμπεριλαμβανομένου του Ηνωμένου Βασιλείου, των Ηνωμένων Πολιτειών και της Αυστραλασίας (Weatherall &Clegg, 1996).
Αλληλογραφία: Καθηγητής Swee L. Thein, Τμήμα Αιματολογικής Ιατρικής, Τμήμα Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας, King’s College London School of Medicine, Denmark Hill, Λονδίνο, SE5 9PJ, Ην. Βασίλειο. E-mail: sl.thein@kcl.ac.uk
Οι φορείς (ετεροζυγώτες) της β-θαλασσαιμίας έχουν κλινικά φυσιολογική εικόνα και συνήθως δεν γνωρίζουν τη γενετική τους πάθηση. Η κληρονόνηση δύο αντιγράφων των γονιδίων της β-θαλασσαιμίας, ένα από κάθε γονέα, συνήθως έχει ως αποτέλεσμα της εκδήλωση απειλητικής για τη ζωή αναιμίας και την εξάρτηση του ατόμου από τη μετάγγιση αίματος για την επιβίωσή του. Οι ενδιάμεσες κλινικές εκδηλώσεις της νόσου αναφέρονται ως ενδιάμεση θαλασσαιμία, η οποία χαρακτηρίζεται από την μετρίως σοβαρή αναιμία και την περιστασιακή ανάγκη για μετάγγιση αίματος. Το πρότυπο θεραπείας για τις σοβαρές μορφές της νόσου (μείζων θαλασσαιμία) είναι η μετάγγιση αίματος και η επιθετική διαχείριση των επιπλοκών, συμπεριλαμβανομένης της εφ όρου ζωής θεραπείας αποσιδήρωσης. Οι επιπλοκές της υπερφόρτωσης σιδήρου, σε συνδυασμό με τις επακόλουθες συνέπειες της αναιμίας και της αναποτελεσματικής ερυθροποίησης, και αυτή καθαυτή η θεραπεία αποσιδήρωσης, είναι από τις βασικές αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας στις εξαρτώμενες από μετάγγιση β-θαλασσαιμίες (Weatherall &Clegg, 2001).
Παρόλο που η συχνή μετάγγιση αίματος σε συνδυασμό με την επιθετική αποσιδήρωση έχουν επιδείξει αξιοσημείωτη αποτελεσματικότητα στην καθυστέρηση της έξαρσης της σχετιζόμενης με τα ποσοστά σιδήρου οργανικής ανεπάρκειας και στη βελτίωση της θνησιμότητας, πολλοί ασθενείς συνεχίζουν να προσβάλλονται από καρδιακές παθήσεις και καθυστερημένη εφηβική ωρίμανση, ενώ αναπτύσσουν και ενδοκρινική ανεπάρκεια (Borgna-Pignatti et al, 2004). Επιπλέον, η αφοσίωση στο εν λόγω εντατικό, εφ όρου ζωής θεραπευτικό σχήμα είναι δυσβάσταχτο και τεράστιο φορτίο για την ποιότητα ζωής. Επομένως, η συνεχής αναζήτηση για μια στρατηγική με μοριακή βάση, η οποία, στην καλύτερη δυνατή περίπτωση, θα οδηγεί σε ίαση ή, κατ' ελάχιστον, θα βελτιώνει την αναιμία στις περιπτώσεις σοβαρής, εξαρτώμενης από μετάγγιση β-θαλασσαιμίας.
Η μοριακή παθοφυσιολογία της β-θαλασσαιμίας
Ένα από τα πρώτα εμπόδια που συναντούμε στη σχεδίαση μιας αποτελεσματικής γονιδιακής θεραπείας στην β-θαλασσαιμία είναι η κατανόηση της οργάνωσης και ρύθμισης των γονιδίων σφαιρίνηςβ-τύπου. Αυτά εμφανίζονται με τη μορφή συμπλέγματος που καταλαμβάνει περιοχή 80 kb στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 11 (Grosveld et al, 1993). Η έκφραση αυτών των γονιδίων περιορίζεται στα ερυθροκύτταρα και ρυθμίζεται καθ' όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης, με την επακόλουθη έκφραση των e (εμβρυονικών), Gc και Ac (εμβρυϊκών), d και b (ενήλικων) γονιδίων. Η έκφραση των μεμονωμένων γονιδίων των σφαιρινών ανάλογα με τον ιστό και το αναπτυξιακό στάδιο ρυθμίζεται από τις άμεσες φυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της ανοδικής περιοχής ελέγχου του γονιδιακού τόπου της β-σφαιρίνης (β-LCR) και των υποκινητών της σφαιρίνης, οι οποίες μεσολαβούνται μέσω της πρόσδεσης ιστο-ειδικών και πανταχού παρόντων παραγόντων μεταγραφής (Grosveld et al, 1998).
© 2006 Οι Συγγραφείς Πρώτη διαδικτυακή δημοσίευση στις 27 Οκτωβρίου 2006
Ανασκόπηση
Η β-LCR αποτελείται από πέντε προστατευμένες θέσεις υπερευαισθησίας (HS) σε DNase1, οι οποίες αναφέρονται ως HS1–5, εντοπισμένες 6 έως 18 kb ανοδικά του γονιδιακού συμπλέγματος. Η περιοχή δρα ως ενισχυτής της έκφρασης του γονιδίου της σφαιρίνης β-τύπου και είναι ζωτικής σημασίας για την έκφραση σε υψηλά επίπεδα όλων των γονιδίων του συμπλέγματος.
Η επακόλουθη έκφραση διαφορετικών σφαιρινών β-τύπου κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης επίσης απαιτεί σίγηση γονιδίων, μια διεργασία που περιλαμβάνει την πρόσδεση κατασταλτικών πρωτεϊνών στις περιοχές ‘σίγησης’, ανοδικά του γονιδίου. Μια πρωτεΐνη που ονομάζεται BP1, που προέρχεται από πυρηνικό εκχύλισμα των κυττάρων K562, έχει δείξει ότι προσδένεται στο DNA ανοδικά του γονιδίου της β-σφαιρίνης, σε μια περιοχή που παρουσιάζει αρνητική ρυθμιστική λειτουργία (Berg et al, 1989). Οι δομικές πυρηνικές πρωτεΐνες, όπως η ομάδα υψηλής κινητικότητας Y-1, θεωρείται ότι εμπλέκονται στη διαδικασία ‘κύρτωσης’ του DNA προς διευκόλυνση της πρόσδεσης της BP1 (Chase et al, 1999). Οι θεραπείες που αναστέλλουν την πρόσδεση της BP1 θα μπορούσαν επομένως να οδηγήσουν σε αυξημένη έκφραση της β-σφαιρίνης.
Η β-θαλασσαιμία εκδηλώνεται όταν υπάρχει ποσοτική μείωση των αλυσίδων β-σφαιρίνης, οι οποίες συνήθως είναι δομικά φυσιολογικές (Weatherall &Clegg, 2001). Η ελλειπτική παραγωγή β-σφαιρίνης προκαλείται από μεταλλάξεις που επηρεάζουν διαφορετικά επίπεδα της αλληλουχίας της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Φαινόμενα εξάλειψης που να επηρεάζουν το γονίδιο της β-σφαιρίνης είναι σπάνια. Η συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων β-θαλασσαιμίας προκαλούνται από σημειακές μεταλλάξεις (όπως η αντικατάσταση μίας βάσης), ελάσσονες προσθήκες ή απαλοιφές, οι οποίες επηρεάζουν τη μεταγραφή, την επεξεργασία, τη μετάφραση και τη σταθερότητα του RNA (Forget, 2001). Οι β-θαλασσαιμίες μπορούν επίσης να προκληθούν από μεταλλάξεις που προσβάλλουν τους αλληλεπιδρώντες παράγοντες μετάφρασης (γενικά, TF11H, και ερυθροειδική, GATA1) (Viprakasit et al, 2001; Yu et al, 2002).
Από λειτουργικής άποψης, οι μεταλλάξεις μπορούν να ταξινομηθούν ως β°, περίπτωση στην οποία υπάρχει πλήρης απουσία παραγωγής β-σφαιρίνης, και β+θαλασσαιμία, όπου υπάρχει παραγωγή β-σφαιρίνης αλλά είναι μειωμένη. Οι λιγότερο σοβαρές εκδηλώσεις της β-θαλασσαιμίας περιλαμβάνουν την β++ και την βσιωπηρή, οι οποίες αναπαριστούν το ελάχιστο δυνατό έλλειμμα στη σύνθεση της β-αλυσίδας. Παρόλο που η β-θαλασσαιμία συνήθως κληρονομείται με τη μορφή "απλο-ανεπαρκών" μεντελικών υπολειπομένων, η κληρονόμηση των διαφορετικών αλληλομόρφων β°, β+, β++ και βσιωπηρή σε διαφορετικούς συνδυασμούς ομόζυγων και σύνθετων ετερόζυγων καταστάσεων, έχει αναδείξει το φάσμα της σοβαρότητας της νόσου εντός του συνδρόμου της β-θαλασσαιμίας (Θεραπεία, 2004).
Μια προσεκτικότερη παρατήρηση των γενοτυπικών/φαινοτυπικών συσχετισμών επιβεβαιώνει ότι η σοβαρότητα της νόσου συσχετίζεται άμεσα με την ποσοτική μείωση της παραγωγής β-σφαιρίνης (Thein, 2005a). Παρόλο που μειώνεται η παραγωγή β-σφαιρινικών αλυσίδων, η σύνθεση της β-σφαιρίνης συνεχίζεται φυσιολογικά στη β-θαλασσαιμία, κάτι που έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση περίσσειας μη αντιστοιχισμένων β-σφαιρινικών αλυσίδων στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα. Οι ελεύθερες β-σφαιρινικές αλυσίδες δεν έχουν τη δυνατότητα να σχηματίσουν βιώσιμα τετραμερή. Καθιζάνουν στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα, σχηματίζοντας συσσωματώματα και προκαλώντας φθορές στη μεμβράνη των RBC και, επομένως, πρόωρη καταστροφή των πρόδρομων ερυθροκυττάρων στο μυελό των οστών (μη αποτελεσματική ερυθροποίηση) (Schrier, 2002). Επομένως, οι παράγοντες που μειώνουν τη διαταραχή και την έκταση της περίσσειας των β-αλυσίδων, όπως η συν-κληρονομικότητα της β-θαλασσαιμίας ή η εγγενής δυνατότητα αύξησης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF, α2γ2), θα έχουν βελτιωτική επίδραση στη νόσο (Σχ. 1).
Η σταδιακή αποσαφήνιση της παθοφυσιολογίας της β-θαλασσαιμίας, μια διαδικασία για την οποία απαιτήθηκαν παραπάνω από 50 έτη βιοχημικών και βιολογικών μελετών, έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών στην προσπάθεια ίασης ή βελτίωσης της νόσου (Thein, 2005b). Αυτοί οι δυνητικοί στόχοι της θεραπείας μπορούν να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες (Πίνακας I):
1 Πρωτεύοντες στόχοι, συμπεριλαμβανομένων των γενετικών ελαττωμάτων, εδράζονται στη ρίζα της μειωμένης έκφρασης της β-σφαιρίνης.
2 Δευτερεύοντες στόχοι, έχουν ως σκοπό τη βελτίωση της διαταραχής των α/β-σφαιρινικών αλυσίδων. και
3 Τριτεύοντες στόχοι, οι οποίοι είναι αυτοί που έχουν ως σκοπό την αντιμετώπιση των επιπλοκών της β-θαλασσαιμίας.
Πρωτεύων στόχος –διορθωτική γονιδιακή θεραπεία στη β-θαλασσαιμία
Η στόχευση των βασικών αιτιών πρόκλησης της μειωμένης παραγωγής β-σφαιρίνης περιλαμβάνει διάφορες στρατηγικές, όπως η μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCT) και η γονιδιακή θεραπεία χρησιμοποιώντας τους κατάλληλους ιϊκούς φορείς (viral vectors) και αντιαγγελιοφόρο mRNA.
HSCT
Η μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων είναι θεωρητικά η απλούστερη και η μοναδική προσέγγιση μέχρι στιγμής, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε οριστική θεραπεία της β-θαλασσαιμίας. Οι ασθενείς που έχουν τις καλύτερες πιθανότητες να αποκομίσουν μεγαλύτερο όφελος είναι αυτοί με πρώιμη αλλά σοβαρή εξαρτώμενη από μετάγγιση νόσο, οι οποίοι έχουν περιορισμένες συνοσηρότητες. Ακόμα και στις καλύτερες δυνατές συνθήκες, δηλ. μεταμόσχευση από συγγενή δότη απόλυτα συμβατό ως προς το αντιγόνο λευκοκυττάρων (HLA), η συγκεκριμένη θεραπεία σχετίζεται με 5% θνησιμότητα. Αυτοί οι ασθενείς εξακολουθούν να διατρέχουν τον κίνδυνο ανάπτυξης φθορών στους ιστούς, όπως ελαττωματική ανάπτυξη, γοναδική βλάβη και χρόνια νόσος μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (GVHD) (Gaziev & Lucarelli, 2003).
Σε μια μελέτη 68 ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία (μέση ηλικία 15 έτη) που είχαν λάβει βλαστοκύτταρα από μη συγγενείς, απόλυτα συμβατούς ως προς το HLA δότες με σχήμα προετοιμασίας για μυελοκαταστροφική θεραπεία (myeloablative conditioning), αναφέρθηκε ότι το 20% των ασθενών της μελέτης κατέληξαν από παράγοντες που σχετίζονται με τη μεταμόσχευση. Το 40% είχε βαθμού II–IV GVHD, το 18% χρόνια GVHD και το 13% κύρια ή δευτερεύουσα αποτυχία μοσχεύματος. Η Ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) φαίνεται να σχετίζεται με την ταξινόμηση κινδύνου κατά Pesaro, η οποία συνίσταται στην προηγούμενη χρήση θεραπείας αποσιδήρωσης και στην παρουσία ηπατικής νόσου. Η DFS ήταν 80% στους ασθενείς χαμηλού κινδύνου, ενώ μειωνόταν στο 54% στους ασθενείς που θεωρούνταν υψηλού κινδύνου, οι οποίοι ήταν εκείνοι που δεν είχαν λάβει τακτική θεραπεία αποσιδήρωσης, και που πάσχουν τόσο από ηπατομεγαλία όσο και από ίνωση (La Nasa et al, 2005). Τα σχήματα προετοιμασίας πλήρους μυελοκαταστροφής που χρησιμοποιούνται στις μεταμοσχεύσεις σχετίστηκαν σταθερά με τα αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας σχετιζόμενης με τη μεταμόσχευση (TRM). Αυτά τα σχήματα θεωρήθηκαν απαραίτητα για την εξάλειψη των θαλασσαιμικών κλώνων, ούτως ώστε να αποτραπεί η απόρριψη ή η αποτυχία του μοσχεύματος.
Ωστόσο, οι πλέον πρόσφατες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι η ομάδα των ασθενών που έχουν σταθερό μικτό χιμαιρισμό (stable mixed chimerism), εκφράζουν επαρκείς ποσότητες λειτουργικής β-σφαιρίνης ούτως ώστε να μην εξαρτώνται από τη μετάγγιση. Οι φυσικές μεταλλάξεις έχουν επίσης παράσχει ενδείξεις ότι η μερική έκφραση της β-σφαιρίνης ενδέχεται να αρκεί για να μετατρέψει μια εξαρτώμενη από μετάγγιση αναιμία σε ενδιάμεση θαλασσαιμία. Σε δύο αναφορές περιστατικών σωματικού μωσαϊκισμού του γονιδίου της β-σφαιρίνης (Badens et al, 2002; Galanello et al, 2004), τα πρώτα άτομα σε κάθε οικογένεια που προσβλήθηκαν από τη νόσο (probands) έπασχαν από μετρίως σοβαρή ενδιάμεση θαλασσαιμία, παρόλο που ήταν ιδιοσυστατικά ετεροζυγώτες της κοινής β° μετάλλαξης της θαλασσαιμίας και είχαν φυσιολογικό β γονότυπο. Οι ερευνητές απεκάλυψαν τη σωματική εξάλειψη του χρωμοσώματος 11p15, συμπεριλαμβανομένου του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης, in trans ως προς τη μετάλλαξη της θαλασσαιμίας. Η σωματική εξάλειψη είχε ως αποτέλεσμα ένα μωσαϊκό κυττάρων, 50% με ένα λειτουργικό γονίδιο β-σφαιρίνης και 50% χωρίς κανένα λειτουργικό γονίδιο β-σφαιρίνης (εξαιτίας της εξάλειψης του χρωμοσώματος 11p15). Το συνολικό άθροισμα του προϊόντος του γονιδίου της β-σφαιρίνης ήταν κατά 25% μικρότερο από το κλινικά φυσιολογικό β-θαλασσαιμικό στίγμα.
Οι μελέτες παιδιών με β-θαλασσαιμία που δεν λαμβάνουν μυελοκαταστροφική θεραπεία, παρουσιάζουν ανάμικτα αποτελέσματα. Τα ποσοστά αποτυχίας του μοσχεύματος είναι υψηλότερα σε αυτού του είδους τις μεταμοσχεύσεις, παρόλο που το TRM είναι σημαντικά χαμηλότερο, σύμφωνα με τα αναμενόμενα. Σε μια περιορισμένη μελέτη με επτά ασθενείς, έξι με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCA) και έναν με εξαρτώμενη από μετάγγιση β-θαλασσαιμία, αναφέρθηκε αρχική ενσωμάτωση του μοσχεύματος και απουσία εξάρτησης από τη μετάγγιση για έξι από τους ασθενείς. Ωστόσο, η μείωση της ανοσοκαταστολής οδήγησε σε αποτυχία του μοσχεύματος και επανεμφάνιση της νόσου του λήπτη (Iannone et al, 2003). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σε αντίθεση με αυτά που αναφέρονται από τον Andreani et al (2000), σύμφωνα με τα οποία 27 είχαν επίμονα σταθερούς ανάμικτους χιμαιρισμούς και δεν εξαρτώνταν από τη μετάγγιση. Το πλεονέκτημα επιβίωσης των μη θαλασσαιμικών βλαστοκυττάρων έναντι των θαλασσαιμικών θα υποδείκνυε ότι μερικά μόνο ενσωματωμένα κύτταρα του δότη θα ήταν αρκετά για τη βελτίωση της σοβαρής αναιμίας στις περιπτώσεις μείζονος θαλασσαιμίας. Αυτή η επισήμανση εγείρει τη ρεαλιστική πιθανότητα για αποτελεσματικά σχήματα προετοιμασίας μειωμένης έντασης για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου (Andreani et al, 2000).
Μια προσπάθεια για τον ποσοτικό προσδιορισμό του επιπέδου χιμαιρισμού του δότη που απαιτείται για αποτελεσματική ερυθροποίηση έλαβε χώρα από τον Roberts et al (2005), όπου ένα μαθηματικό μοντέλο βασισμένο σε β-θαλασσαιμικά ποντίκια που υπεβλήθησαν σε μη μυελοκαταστροφική HSCT, προβλέπει ότι για την ίαση απαιτούνται άνω του 80% των ερυθροειδών βλαστοκυττάρων του δότη, σε ανάμικτη χίμαιρα (Roberts et al, 2005).
Παρόλο που η πιθανότητα μείωσης του TRM με τις εν λόγω στρατηγικές μοιάζει υποσχόμενη, το μεγάλο εμπόδιο στην χρήση HSCT ως θεραπεία ρουτίνας για τη μείζονα β-θαλασσαιμία είναι η έλλειψη κατάλληλων δοτών. Η χρήση συγγενών ή μη μοσχευμάτων από αίμα ομφάλιου λώρου έχει διευρύνει της δεξαμενή των δοτών, αλλά οι μεταμοσχεύσεις αίματος ομφάλιου λώρου έχουν μέχρι στιγμής περιορισμένη επιτυχία στη θεραπεία της β-θαλασσαιμίας εξαιτίας του μεγάλου αριθμού των μεταμοσχευμένων κυττάρων που απαιτούνται για τη διατήρηση της αιμοποίησης (Locatelli et al, 2003; Fang et al, 2004). To αίμα ομφάλιου λώρου ενδέχεται να είναι περισσότερο επιτυχημένο αν η δεξαμενή βλαστοκυττάρων αναπτυχθεί ex vivo.
Γονιδιακή θεραπεία
Η γενετική διόρθωση των αυτόλογων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSC) υπερνικά τα διττό μειονέκτημα της έλλειψης δοτών και του GVHD στην αλλογενετική HSCT. Η ανάπτυξη μιας τέτοιου τύπου αποτελεσματικής θεραπείας γονιδιακής διόρθωσης για τη β-θαλασσαιμία έχει αποδειχθεί μεγαλύτερη πρόκληση απ' ότι αρχικά αναμενόταν. Η γονιδιακή θεραπεία στην β-θαλασσαιμία πρέπει να πληροί τα παρακάτω κριτήρια:
1 ασφαλής και αποτελεσματική ιϊκή ή μη διαμόλυνση,
2 ειδικότητα ως προς την ερυθροειδή σειρά, και
3 θεραπευτικά επίπεδα έκφρασης της β-σφαιρίνης.
Οι πρώιμες προσπάθειες χρησιμοποιώντας ογκορετροϊικούς φορείς του γονιδίου β-σφαιρίνης και τα πυρηνικά στοιχεία της β-LCR ήταν ανεπιτυχείς εξαιτίας της αστάθειας του φορέα, των χαμηλών τίτλων και της μεταβλητής, χαμηλής έκφρασης της ανθρώπινης β-σφαιρίνης (Cone et al, 1987; Dzierzak et al, 1988; Novak et al, 1990; Plavec et al, 1993). Δοκιμάστηκαν φορείς του αδενοσχετιζόμενου ιού (AAV) αλλά λόγω των περιορισμών ως προς το μέγεθος, μόνο τα πυρηνικά στοιχεία της LCR κατάφεραν να εισαχθούν, κι έτσι δεν κατέστη δυνατή η υπερνίκηση της διακύμανσης θέσης της έκφρασης σε μοντέλα ποντικών. Οι εν λόγω δυσκολίες μας οδήγησαν στη διερεύνηση εναλλακτικών ερυθροειδικών μεταγραφικών παραγόντων, όπως η ρυθμιστική περιοχή HS-40 από τον γονιδιακό τόπο της β-σφαιρίνης (Ren et al, 1996), οι υποκινητές αγκυρίνης (Sabatino et al, 2000) και οι υποκινητές μεταλλαγμένης β-σφαιρίνης που σχετίζονται με την κληρονομική παραμονή της HbF (Fragkos et al, 2005). Ωστόσο, όλες οι προσπάθειες είχαν περιορισμένη επιτυχία.
Ο May et al (2000) ανέφερε ότι οι Lenti-ιϊκοί φορείς (LV) που μεταφέρουν ένα μεγάλο τμήμα του ανθρώπινου γονιδίου β-σφαιρίνης, συμπεριλαμβανομένου και ενός μεγάλου τμήματος της LCR, θα μπορούσαν να βελτιώσουν την αναιμία στα β-θαλασσαιμικά ποντίκια. Με τη βοήθεια αυτού του συστήματος θα μπορούσαν να επιτευχθούν σταθερά θεραπευτικά επίπεδα β-σφαιρίνης. Το εν λόγω εύρημα αποτέλεσε το έναυσμα για την ανάπτυξη άλλων Lenti-ιϊκών φορέων με βάση τον HIV-1 για τη γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών, αντικαθιστώντας τα ογκορετροϊικά συστήματα. Σε αντίθεση με τους ρετροϊούς, οι φορείς LV έχουν ξεκάθαρο πλεονέκτημα σε ό,τι αφορά την ικανότητα διαμόλυνσης μη διαιρούμενων κυττάρρων.
Άλλα χαρακτηριστικά των φορέων LV που τους καθιστούν εξαιρετικά κατάλληλους για τη γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών περιλαμβάνουν: σχετική γενωμική σταθερότητα, σχεδιασμός αυτο-αδρανοποίησης (self-inactivating / SIN) που έχει ως αποτέλεσμα την εξάλειψη του ιϊκού LTR (long terminalrepeat) κατά την ενσωμάτωση και επομένως έναν ασφαλέστερο φορέα, και το σχετικό μεγάλο δυναμικό πακεταρίσματος. Οι Lenti-ιϊκοί φορείς μπορούν να μεταφέρουν με σταθερότητα "κασέτες" DNA χωρίς επαναδιευθετήσεις, ένα χαρακτηριστικό που επιτρέπει την ενσωμάτωση μεγαλύτερων τμημάτων LCR και μονωτών χρωματίνης για να ξεπεραστεί το πρόβλημα των επιδράσεων θέσης, με τη δυνατότητα διατήρησης της έκφρασης σε θεραπευτικά επίπεδα. Στην πρωτοποριακή μελέτη του Sadelain και των συνεργατών του χρησιμοποιήθηκε ένας φορέας LV που ονομάζεται TSN9, ο οποίος περιείχε τα HS2, 3 και 4 από την LCR (περίπου 3.2 KB) σε συνδυασμό με ένα εκτεταμένο ανθρώπινο γονίδιο β-σφαιρίνης. Τα διαμολυσμένα ποντίκια με ενδιάμεση β-θαλασσαιμία εμφάνισαν σταθερή αύξηση στις τιμές αιμοσφαιρίνης της τάξης των 38 g/L (May et al, 2000). Ο Imren et al (2002) πέτυχε μόνο μέτρια αύξηση στις τιμές αιμοσφαιρίνης της τάξης των 15 g/L με φορέα LV που μετέφερε τμήμα 2.7 KB της LCR και ένα αντιδρεπανωτικό γονίδιο β-σφαιρίνης, βT87Q, σε ποντικία με ενδιάμεση β-θαλασσαιμία. Τα μειωμένα ποσοστά διόρθωσης σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη του May et al (2000) θα μπορούσαν να αποδοθούν στο μικρότερο τμήμα της LCR που χρησιμοποιήθηκε στον φορέα LV (Imren et al, 2002).
Η μεταγωγή των φορέων SIN-LV που εκφράζουν την β-σφαιρίνη προκάλεσε μια μέση αύξηση κατά 11 g/L στις τιμές αιμοσφαιρίνης σε ποντίκια με ενδιάμεσο φαινότυπο, μια στρατηγική η οποία θα μπορούσε να αποδειχθεί χρήσιμη τόσο στην β-θαλασσαιμία όσο και στην SCA. Ωστόσο, παρατηρήθηκε μεταβλητή έκφραση των φορέων εξαιτίας των επιδράσεων των χρωμοσωμικών θέσεων (Persons et al, 2003). Η μεταγωγή βλαστοκυττάρων με άλλον φορέα LV που ενσωματώνει μεγαλύτερα τμήματα LCR 3.2 KB και το γονίδιο β-σφαιρίνης, είχε ως αποτέλεσμα μεγαλύτερη αύξηση της HbF (17–33%), με μέση αύξηση στη συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης της τάξης των 26 g/L σε ποντικία με ενδιάμεση θαλασσαιμία (Hanawa et al, 2004).
Στις περισσότερες μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί ποντικία με ενδιάμεση θαλασσαιμία και όχι ποντίκια με μείζονα θαλασσαιμία, τα οποία δεν επιζούν της εμβρυϊκής ζωής. Αυτό συμβαίνει επειδή η μετάβαση από την παραγωγή εμβρυϊκής στην παραγωγή ενήλικης αιμοσφαιρίνης στα ποντίκια λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια των ημερών 14–15 της κύησης. Για τη δημιουργία ποντικών με μείζονα θαλασσαιμία, θανάσιμα ακτινοβολημένα ενήλικα ποντίκια έλαβαν μοσχεύματα εμβρυϊκών ηπατικών κυττάρων από τη μείζονα θαλασσαιμία, πριν το θάνατο. Τα μεταμοσχευμένα ποντίκια αναπτύσσουν σοβαρή αναιμία (c. 30 (g/L) και πεθαίνουν εντός 6–8 εβδομάδων από τη μεταμόσχευση. Η μεταμόσχευση ηπατικών κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με φορείς TSN9 έσωσε τα ποντίκια, η πλειοψηφία των οποίων ανέπτυξε φαινότυπο ενδιάμεσης θαλασσαιμίας αντ' αυτού (Rivella et al, 2003).
Σε όλες αυτές τις μελέτες, παρατηρήθηκε μεταβλητή έκφραση φορέων η οποία αποδόθηκε στις επιδράσεις χρωμοσωμικής θέσης. Ο Malik και οι συνεργάτες του έχουν αντιμετωπίσει το εν λόγω ζήτημα σχεδιάζοντας τον Lenti-ιϊκό φορέα aSIN που περιέχει το γονίδιο β-σφαιρίνης/LCR, BG1, ο οποίος κατά την ενσωμάτωση τοποθετείται εκατέρωθεν του μονωτή HS-4 από κοτόπουλο. Τα CD34+ κύτταρα που είχαν υποστεί μεταγωγή από το μυελό των οστών τεσσάρων ασθενών με εξαρτώμενη από μετάγγιση β-θαλασσαιμία, εμφάνισαν υψηλά επίπεδα έκφρασης της β-σφαιρίνης και επίμονη, πλήρη φαινοτυπική διόρθωση σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια (Puthenveetil et al, 2004). Προκλινικές μελέτες που χρησιμοποιούν τα εν λόγω συστήματα LV τρίτης γενιάς βρίσκονται σε εξέλιξη και αφήνουν πολλές υποσχέσεις για κλινικές δοκιμές αναφορικά με τη γονιδιακή θεραπεία στη β-θαλασσαιμία και την SCA.
Συν-ρύθμιση της έκφρασης του διαγονιδίου της σφαιρίνης και επεμβατικό RNA
Το επεμβατικό RNA (RNAi) είναι ένας μετα-μεταγραφικός μηχανισμός σίγησης που παρουσιάζει θεραπευτικό δυναμικό αναφορικά με την εξάλειψη των "ενοχλητικών" γονιδίων, όπως ιϊκά γονίδια και ογκογονίδια και ενδογενή μεταλλαγμένα γονίδια όπως τα αλληλόμορφα β-σφαιρίνης. Για να επιτύχει το θεραπευτικό δυναμικό του, το RNAi θα χρειαστεί εξειδικευμένη για συγκεκριμένη κυτταρική σειρά (lineage restricted) και εξαιρετικά ειδική σίγηση γονιδίων. Ο Samakoglu et al (2006) προσφάτως κατέδειξαν ότι ήταν εφικτός ο συνδυασμός της έκφρασης του διαγονιδίου και του RNAi στις HSC. Κωδικοποίησαν, χωρίς την παρουσία υποκινητή, small hairpin RNA (shRNA) στο ιντρόνιο ενός ανασυνδυασμένου γονιδίου β-σφαιρίνης. Διαμόλυναν CD34+ κύτταρα ασθενών με SCA με LV ανασυνδυασμένο γονίδιο β-σφαιρίνης και κατά την ερυθροποιητική διαφοροποίηση, παρατηρήθηκε έκφραση τόσο του διαγονιδίου της β-σφαιρίνης όσο και του μικρού επεμβατικού RNA (siRNA) με ταυτόχρονη μείωση των ενδογενών βS μεταγραφημάτων. Η εν λόγω τεχνική έχει χρησιμοποιηθεί για τη διόρθωση της SCA αλλά λογικά θα έχει εφαρμογή και στις β-θαλασσαιμίες, καθώς και ως γενική στρατηγική για την ταυτόχρονη προσθήκη ενός στοιχείου και διαγραφή ενός άλλου στο ίδιο κύτταρο.
Ομόλογος ανασυνδυασμός και θεραπευτική κλωνοποίηση
Η ασφάλεια της γονιδιακής θεραπείας έχει τεθεί υπό αμφισβήτηση εξαιτίας του κινδύνου των ογκογονιδίων που ενσωματώνονται, όπως παρατηρήθηκε σε δύο από τους 10 ασθενείς που αντιμετωπίστηκαν επιτυχώς με γονιδιακή θεραπεία για την σοβαρή φυλοσύνδετη συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια. Οι δύο εν λόγω ασθενείς ανέπτυξαν οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία η οποία δύναντο να συσχετισθεί με την ενσωμάτωση ρετροιϊκών φορέων εντός ή πλησίον του ογκογονιδίου LMO2 (Hacein-Bey-Abina et al, 2003).
Παρόλο που οι Lenti-ιϊκοί φορείς SIN, με ή χωρίς στοιχεία απομονωτών, θα έπρεπε να παρέχουν μια ασφαλή και αποτελεσματική θεραπεία, οι ανησυχίες για την ένθετη ογκογένεση εμμένουν. Μια εναλλακτική προσέγγιση συνίσταται στη διόρθωση αυτής καθαυτής της μετάλλαξης μέσω του ομόλογου ανασυνδυασμού, με ένα κομμάτι DNA που μεταφέρει τις φυσιολογικές αλληλουχίες ex vivo, και στη συνέχεια επαναεγχύει τα διορθωμένα βλαστοκύτταρα. Η δυνατότητα επίτευξης της συγκεκριμένης προσέγγισης παρουσιάστηκε πρόσφατα από τον Chang et al (2006) σε ποντίκια με SCA. Τα αιμοποιητικά κύτταρα που προέρχονται από τα διορθωμένα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (ES) των ποντικών με δρεπανοκυτταρική αναιμία, παρήγαγαν HbA καθώς και HbS. Παρομοίως, ο Wu et al (2006) ανέφερε την χρήση του ομόλογου ανασυνδυασμού στα ES κύτταρα ποντικών με SCA, μέσω της αντικατάστασης του ανθρώπινου βs (hβs). Το ανθρώπινο βS γονίδιο στα ES κύτταρα των ποντικών αντικαταστάθηκε από το ανθρώπινο βA γονίδιο, και τα διορθωμένα ES εγχύθηκαν στις βλαστοκύστες των ποντικών. Τα ποντίκια που προκύπτουν από τη διαδικασία διόρθωσης των ES κυττάρων είχαν HbA/HbS γονότυπο και εξέφραζαν το ανθρώπινο HbA. Ο φαινότυπός τους ήταν παρόμοιος με αυτόν των ανθρώπων με δρεπανοκυτταρικό στίγμα. Ένα πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι αποφεύγει τον κίνδυνο της ιογενούς μεταλλαξογέννησης. Αυτά τα πειράματα παρέχουν απόδειξη αρχής αναφορικά με το γεγονός ότι η γονιδιακή θεραπεία μέσω του ομόλογου ανασυνδυασμού σε ex vivo ES κύτταρα είναι μια πιθανή προσέγγιση για τις αιμοσφαιρινοπάθειες.
Η πρόκληση πλέον βρίσκεται στη μετάφραση των εν λόγων αρχών σε ανθρώπους ασθενείς, ενώ σίγουρο είναι πως πρέπει να γίνουν αρκετά βήματα πριν αυτή η προσέγγιση καταστεί θεραπευτική πραγματικότητα. Θα πρέπει να εξαχθούν ειδικά για κάθε ασθενή ES κύτταρα μέσω της πυρηνικής μεταφοράς σωματικών κυττάρων και να ακολουθήσει διόρθωση του μεταλλαγμένου γονιδίου. Τα διορθωμένα κύτταρα θα πρέπει στη συνέχεια να διαφοροποιηθούν σε HSC in vitro και να μεταμοσχευθούν στον ασθενή.
Θεραπευτικό αντινοηματικό mRNA
Περίπου μισές από τις μεταλλάξεις της β-θαλασσαιμίας συνίστανται στην μη φυσιολογική συρραφή του RNA. Μελέτες προ δεκαετίας έχουν δείξει ότι τα αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν περιοχές μη φυσιολογικής συρραφής δύνανται να επαναφέρουν την ορθή συρραφή σε ερυθρολευχαιμικές κυτταρικές σειρές (Sierakowska et al, 1996). Πιο πρόσφατα, η χρήση των αποκαλούμενων ολιγονουκλεοτιδίων μορφολίνης έχει καταστήσει δυνατή την υψηλού επιπέδου διόρθωση του μεταγεγραμμένου μεταλλαγμένου mRNA της β-σφαιρίνης. Αυτά είναι ολιγονουκλεοτίδια όπου οι δακτύλιοι δεσοξυριβόζης που συνδέονται με τα νουκλεϊκά οξέα μέσω ανιοντικών φωσφορικών αλάτων έχουν αντικατασταθεί με δακτυλίους μορφολίνης που συνδέονται με ομάδες φωσφοδιαμμίνης, οι οποίες είναι ουδέτερα φορτισμένες. Αυτό επάγει την αντίσταση των ολιγονουκλεοτιδίων στις RNAάσες. Επιπλέον, οι μορφολίνες, σε αντίθεση με το θειοφωσφορικό siRNA, δεν προωθούν την αυλάκωση του στοχευόμενου mRNA μέσω της RNAάσης H. Ωστόσο, η έλλειψη ανιοντικού φορτίου σημαίνει ότι οι μορφολίνες δεν μπορούν να εισαχθούν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας τα τυπικά κατιοντικά λιπιδικά επιμολυσμένα κύτταρα. Αντ' αυτού, θα πρέπει είτε να εγχυθούν με σύριγγα σε καλλιεργημένα κύτταρα είτε μέσω της ελεύθερης πρόσληψης ολιγονουκλεοτιδίων με τη βοήθεια της παρατεταμένης έκθεσης σε καλλιεργημένα πρόδρομα ερυθροειδή, όπου έχει επιδειχθεί ότι επιτυγχάνεται έως και 80% διόρθωση σε ανθρώπινα ερυθροειδή κύτταρα με μετάλλαξη θέσης συρραφής IVS2–654 (Suwanmanee et al, 2002a).
Αυτή η διαδικασία έχει επιπτώσεις στη θεραπεία της β-θαλασσαιμίας/HbE, μια σύνθετη ετερόζυγη κατάσταση που συναντάται συχνά στη νοτιοανατολική Ασία και βασική αιτία της μείζονος θαλασσαιμίας στη συγκεκριμένη περιοχή (Weatherall &Clegg, 2001). Η σημειακή μετάλλαξη που ευθύνεται για την HbE είναι επίσης θαλασσαιμική, καθώς ενεργοποιεί μια απόκρυφη θέση συρραφής προκαλώντας μη φυσιολογική συρραφή του mRNA, απομειώνοντας ταυτόχρονα την φυσιολογική συρραφή που παράγει την HbE. Καθώς η ποσότητα της HbE μειώνεται, η σύνθετη ετερόζυγη κατάσταση με β-θαλασσαιμία έχει ως αποτέλεσμα την κλινικά σημαντική αναιμία. Τα ολιγονουκλεοτίδια μορφολίνης έχουν δείξει ότι διορθώνουν τη μη φυσιολογική θέση συρραφής σε κύτταρο HeLa που φέρει θαλασσαιμικές μεταλλάξεις βE/IVS1–6. Το επιδιορθωμένο βE-mRNA ήταν σταθερό και μεταφράστηκε σε πλήρες βE πολυπεπτίδιο σφαιρίνης (Suwanmanee et al, 2002b). Ωστόσο, η ικανότητα των πρόδρομων ερυθροκυττάρων, τα οποία τροποποιούνται ex vivo και επαναεγχύονται, αναφορικά με την έκφραση σε επαρκώς υψηλά επίπεδα λειτουργικής β-σφαιρίνης παραμένει μη δοκιμασμένη. Έως σήμερα δεν υπάρχουν δημοσιευμένες μελέτες επιτυχημένης in vivo χρήσης του θεραπευτικού αντινοηματικού mRNA.
|
More Less | | Master's degree - Heriot-Watt University, School of Managements and Languages, M.Sc. in Translation and CAT Tools | | Years of translation experience: 7. Registered at ProZ.com: Jan 2008. Became a member: Mar 2008. | | English to Greek (Heriot Watt University (Edinburgh), verified)
Greek to English (Heriot Watt University (Edinburgh), verified)
| | N/A | | Adobe Acrobat, Adobe Photoshop, Alchemy Publisher, Catalyst, DejaVu, Dreamweaver, FrameMaker, Indesign, Logoport, Microsoft Excel, Microsoft Office Pro, Microsoft Word, SDL Trados Studio 2009, Passolo, Powerpoint, SDL TRADOS, SDLX | | http://www.mantas-translations.com | | English (PDF) | | Conferences attended | | Dimitris Mantas endorses ProZ.com's Professional Guidelines. | | About me Web: www.mantas-translations.com | Blog: Greek Translation and the Web | Skype: dimitris_madas | Email: dimitris{at}mantas-translations.com | Twitter: translategreek
Professional English<->Greek Translation Services
For the past 7 years I have been working as a professional freelance English to Greek & Greek to English translator and localizer. My fields of specialization are: Medical, Pharmaceutical, Financial, Technical Documents, Translation of Websites and Software (Localization / Globalization). I have collaborated mainly with large corporations and agencies providing English to Greek translation services (and vice versa), and have worked on several subjects and document formats.
I can handle many different file formats and Translation Memory systems, and my daily capacity is 3.500-4.000 words/day. Feel free to contact me with any queries or for a free quote on your project. In conclusion, I believe that through my work experience and the background I have acquired through my studies, I can offer English-Greek Translation services of the highest quality for your business!
Voluminous projects completed for (by sector):Medical/Pharmaceutical/Medical Technology:
Pharmaxis * Dechra Veterinary Products * Biogen Idec Neurology MS * Facet Biotech * BIOGEN IDEC * Philips Medical * Collin Medical * Sutter Medizintechnik GmbH * Xion Medical * Glaxosmithkline * ASAS assessment of spondyloarthritis International Society * Accuray Incorporated * alco - advanced lightweight constructions GmbH * Osseon Therapeutics * BioAlliance pharma * Labtec GmbH * Abbott Diabetes Care * Abbott Laboratories * Molmed S.p.A * Laboratorios LICONSA, S.A. * Cougar Biotechnology Inc. * ANDRÉS PINTALUBA S.A. * Laboratorios CINFA, S.A * Carestream Health * Biomerieux sa * Actavis hf * Pfizer * GE Healthcare * Futuro * Vasotop * Intervet/Schering-Plough Animal Health * Novartis * Actelion pharmaceuticals Netherlands BV * Smith & Nephew, Inc. * Biorad Laboratories * Trilux * Merck * Sanofi Aventis * Sandoz Healthcare * 3M Microbiology * Durolane * Stryker Orthopeadics * FertiPro * Medizinprodukte GmbH & Co.KG * Bard Davol Inc. * Bio-Rad * BAXTER INTERNATIONAL INC. - USA * Novo Nordisk A/S * Bracco International B.V. * AstraZeneca * KCI * Aisys * Biosite Inc * Impac Medical Systems, Inc. * ELEKTA Neuroscience * Perceptive Informatics * Beckman-Coulter * Covidien * ROCKET MEDICAL * Vioser
Engineering/Electronics:
STALKER ENGINEERING PTY LTD * Øsløs Maskinfabrik ApS * GE Power Generation * Pentel * Acheson Colloiden, B.V. * NAVIGON AG * Daikin * Honeywell * Hypertherm * Frymaster * SilverCrest * Pioneer * Philips * Dell * Cisco * Motorola * Sony Ericsson * Alcatel * Braun * GE Energy * Fisher * Swagelok * Drycall * GRUNDFOS * Meggitt * co-ax valves inc. * Patterson * Knauf * Lego * Oral B * Shell Aviation
Computers/IT/Software/Hardware:
Adobe * Vodafone * Castle Steps Marketing * Siemens * Expedia * Symantec * Mcafee * ABB * Skype * OKI Printing Solutions * Epson * Sharp * HP * Xerox
Cars/Trucks/Motorcycles:
Bär Cargolift® * NEW Holland * Piaggio * Yamaha * Epsrit * Mercedes Benz * Toyota
Marketing/Business/Economics:
Oxford University Press * Depend LTD * Sterci * Forex Trading * Prologis * PR Newswire
StudiesMaster of Science (M.Sc.) with distinction in Translation And Computer Assisted Translation Tools - Heriot-Watt University - Scotland, UK (click to view scan)
Translation Diploma (grade A-) from the English-Greek Translation course of Metafrasi School of Translation Studies (click to view scan)
Graduand in the Department of Chemistry (BSc), University of Athens
TrainingSummer School in Screen Translation (Subtitling, Dubbing, Audio Description) in Bertinoro (Italy), May 2009, University of Bologna (click to view scan)
Certificate in Subtitling from the Seminar in Subtitling of metafrasi School of Translation Studies (click to view scan)
Certificate in Translation Memories from the seminar in Translation Memories of metafrasi School of Translation Studies (click to view scan)
Computer SkillsWindows 2000/XP/Vista/7 #Adobe Acrobat/InDesign/Fireworks/Dreamweaver
Excellent knowledge of Microsoft Office 2000/2003/2007/2010
SEO / Internet Applications / Social Media / Blogging / PPC / Web Marketing
Web Design (www.mantas-translations.com / www.thetranslationbooth.co.uk / www.medical-translations.gr / www.takemywordforit.de)
Translation Memory SystemsSDL TRADOS 2007 (SDL Certified - Level 3 - Advanced)
SDL Trados Studio 2009 (SDL Certified - Level 3 - Advanced)
DejaVuX 3.5 (ATRIL Certification)
STAR Transit (Good level)
SDLX (Excellent level)
Logoport (Excellent level)
Translation Workspace (Good level)
Across (Good level)
Web: www.mantas-translations.com | Blog: Greek Translation and the Web | Skype: dimitris_madas | Email: dimitris{at}mantas-translations.com | Twitter: translategreek
| This user has earned KudoZ points by helping other translators with PRO-level terms. Click point total(s) to see term translations provided.
|
|
Keywords: english, greek, translation, translator, greek translation, greek translator, english to greek, greek to english, μεταφράσεις, μετάφραση, μεταφραστής, μεταφραστές, ιατρικές μεταφράσεις, ιατρική μετάφραση, τεχνικές μεταφράσεις, τεχνική μετάφραση, οικονομικές μεταφράσεις, οικονομική μετάφραση, greek translator, english greek translation, greek english translation, greek translator, english greek translator, translations, greek translation, greek translations, translation, english greek translator, technical, localization, medical, pharmaceutical, technical, IT, manuals, greek native, mantas-translations, medical-translations, financial, localization, fast service, medical translation, translation services, professional translation services, business translation, business translation services, english greek translation, english greek
Profile last updated
17:41 |
The translation workplace 
Dynamic content (javascript) disabled in this profile. 
