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Italian to English: Molecular Physiology of Mammalian Glucokinase General field: Science Detailed field: Biology (-tech,-chem,micro-)
Source text - Italian Review
Molecular Physiology of Mammalian Glucokinase
P. B. Iynedjian
Department of Cell Physiolgy and Metabolism, University of Geneva School of Medicine,
CMU 1 Rue Michel-Servet, 1211 Geneva 4 (Switzerland), Fax: 41 22/379 55 43,
e-mail: [email protected]
Received 11 June 2008; received after revision 18 July 2008; accepted 30 July 2008
Online First 26 August 2008
Abstract. The glucokinase (GCK) gene was one of the first candidate genes to be identified as a human “diabetes gene”. Subsequently, important advances were made in understanding the impact ofGCKin the regulation of glucose metabolism. Structure elucidation by crystallography provided insight into the kinetic properties of GCK. Protein interaction partners of GCK were discovered. Gene expression studies revealed new facets of the tissue distribution of GCK, including in the brain, and its regulation by insulin in the liver. Metabolic control analysis coupled to gene overexpression and knockout experiments highlighted the unique impact of GCK as a regulator
of glucose metabolism. Human GCK mutants were studied biochemically to understand disease mechanisms.
Drug development programs identified small molecule activators ofGCKas potential antidiabetics.
These advances are summarized here, with the aim of offering an integrated view of the role of GCK in the molecular physiology and medicine of glucose homeostasis.
This review focuses on the enzyme known as mammalian glucokinase. Somewhat ironically, this enzyme is actually not a glucokinase in the strict sense, denoting a glucose phosphorylating enzyme with stringent substrate specificity for glucose, such as exists in lower organisms. Mammalian glucokinase is able to phosphorylate hexoses like mannose or fructose in addition to glucose, a property shared with three other hexokinases present at various levels and in various combinations in human, rat, and mouse tissues [1].
The four mammalian isoenzymes display extensive sequence identities, leaving no doubt about a close phylogenetic relationship [2], and arguing for the terminology hexokinases I – IV (or A– D), in which hexokinase IV (or D) designates mammalian glucokinase.
In spite of these considerations, the term glucokinase has become entrenched in tradition, probably because it conveys a sense of the very unique role of this enzyme in the regulation of glucose homeostasis. This tradition is followed in the current article, with the understanding that glucokinase (GCK) stands for hexokinase IV (or D). Whether the name should be reconsidered in the future is an open question, because a gene encoding a functional ADP-dependent glucokinase reminiscent of primitive organisms was recently identified in the mouse and human genomes [3]. The level of activity and physiological role of this enzyme in mammalian tissues are currently unknown.
Glucokinase was identified as an enzyme of rat liver in 1962. In 1992, two studies using the candidate gene approach reported a genetic linkage between a form of maturity onset diabetes of the young, named MODY 2, and the GCK gene [4, 5]. This discovery came as the culmination of three decades of research in biochemistry, physiology and molecular biology, which collectively demonstrated the preferential expression of GCK in hepatocytes and b-cells of the pancreas, and suggested a key role in glucose metabolism. These investigations, which had conferred to
GCK the rank of prime candidate as a “diabetes gene”, were the subject of two reviews published in
1993 [6, 7].
In recent years our perception of the pivotal role of GCK in the regulation of glucose metabolism has been reinforced by important results in a variety of experimental areas. Structural investigations by Xray crystallography shed new light on the very special enzyme kinetics of GCK. Gene expression studies revealed novel facets of the tissue distribution of GCK, notably in brain, and of the insulin regulation of expression in the liver. Genetic manipulations in cells and mice led to major advances in our understanding of the glucose sensor function of GCK at the cellular level and its impact on whole body glucose homeostasis. This article was written to assemble knowledge from very diverse lines of investigation, with the aim of offering an integrated view of the unique place of GCK in physiology and medicine.
Three-dimensional structure of GCK: cooperative glucose kinetics explained
Glucose taken up by mammalian cells has to be converted into glucose 6-phosphate as a prelude to
further utilization for glycolysis, the pentose phosphate pathway or glycogen synthesis. Although some contribution to overall glucose phosphorylation by the recently identified ADP-dependent glucokinase [3] cannot be ruled out, the bulk of glucose phosphorylation occurs at the expense of ATP in the generic reaction catalyzed by the hexokinases: hexose ATP → hexose 6-phosphate ADP [8].
Among the hexokinases, GCK displays unique enzyme kinetics in two respects. First, GCK has an
affinity for glucose (S0.5 ffi 6 mM) more than 20 times lower than that of the next ranking hexokinase, hexokinase II. Second, the rate of the GCK reaction displays a sigmoid rather than hyperbolic dependence on glucose concentration [1]. These two kinetic properties, low affinity and cooperativity with respect to glucose, allow GCK to operate as an ultrasensitive physiological glucose sensor in cells endowed with non-limiting glucose transport activity at the plasma
membrane (see below).
The cooperativity of GCK with glucose cannot be explained by the classical mechanisms of allostery for multisubunit proteins, because GCK is catalytically active in the monomeric state [9]. Moreover, GCK harbours a single glucose binding site (the active site) [10], excluding the possibility of multisite allostery in which two molecules of glucose would bind simultaneously
to the enzyme. Deviation from hyperbolic kinetics is sometimes noted for monomeric enzymes
in case of random addition of substrates, but this is not the case for theGCKcatalytic cycle, which involves an ordered addition of substrates in which glucose binds first and ATP second [11]. A mechanism of positive cooperativity applicable to monomeric enzymes, named the mnemonic model, was proposed for GCK on the basis of early enzymological investigations [12].
Predictions from the mnemonic model were confirmed by recent studies using pre-steady-state measurements of the intrinsic fluorescence of GCK during binding of glucose and other ligands [13, 14]. The mnemonic mechanism of cooperativity includes the following features: i) equilibrium between two conformational states of GCK with vastly different glucose affinities; ii) large predominance of the low affinity conformation in the absence of glucose; iii) slow interconversion between the conformational states for glucose-free GCK; iv) conversion from the low affinity to the high affinity conformational state strongly accelerated upon glucose binding to GCK; v) only the high affinity form of the enzyme is catalytically competent, and the rate of the catalytic step(s) is
very fast compared to the conformational transition rate.
Explicit support for the model came recently from structural data on human GCK obtained by Kamata and colleagues, who solved the structure of GCK by X-ray crystallography [15]. Crystals were obtained from GCK with short truncations at the NH2-terminal end (11 or 15 amino acids) under two distinct crystallization conditions: in the presence of glucose plus a small-molecule activator of GCK (see below), or in the absence of any ligand. The overall structure of the protein was comprised of a large and a small globular domain connected by a hinge made up of three flexible loops. With glucose and the activator present, the space between the two domains assumed
the shape of a narrow, deep cleft containing the glucose binding pocket. The binding site for the
activator was also localized in the hinge region, at a distance from the glucose binding pocket. The structure was very similar to that of the C-terminal half of hexokinase I crystallized in the presence of glucose, called the closed form of hexokinase, and was therefore designated the “closed” form of GCK. By contrast, GCK crystals formed without ligands displayed the so-called “super-open” conformation. In this configuration, the cleft space between the two domains of GCK was much broader, as the result of two conformational changes compared to the closed form: tilt and rotation of the small domain with respect to the large domain, and extensive rearrangement of the secondary structural elements of the small domain itself [15].
The two X-ray structures of GCK could readily be fitted into the mnemonic model of enzyme mechanism. The super-open conformation represents the low glucose affinity, catalytically inactive form of enzyme. The closed conformation corresponds to the high affinity form of GCK with glucose and ATP bound at the active site during catalysis.An additional conformation of GCK, intermediary between the super-open and the closed states, was postulated for the high affinity form of the enzyme free of substrates or products. This putative conformation was designated the “open” form. The crystal structure of GCK in the open form remains to be established. However, X-ray diffraction studies of crystals of the C-terminal half of hexokinase I formed in the absence of glucose can serve as a model for the open form. Compared to the closed form, the open form displayed a wider interdomain cleft due to slight twist of the small domain relative to the large domain, without change in the internal topology of the small domain core [16].
The transition between open and closed conformations would be very fast and easily reversible, in
contrast to the more complex molecular reorganization involved in the slow transition from the superopen to the open conformations. Indeed, the prediction of an intermediary open state of GCK was borne out in a recent study using targeted molecular dynamics simulation to dissect the transition from the closed to the super-open configurations of GCK [17].
Regulation of glucokinase activity by protein-protein interaction
Interaction with hepatic glucokinase regulatory protein. The best understood mechanism of rapid regulation of GCK activity relies on protein-protein interaction between GCK and a partner termed
GCK regulatory protein (GCKR). The association between the two proteins is ligand-dependent and
inhibitory to GCK activity. Ligands for GCKR are fructose-6-phosphate and fructose-1-phosphate,
which are mutual competitors. Binding of fructose 6- phosphate to GCKR favors the GCKR-GCK interaction with a negative effect on enzyme activity, while binding of fructose-1-phosphate weakens the GCKRGCK interaction and releases active GCK. Intrahepatic fructose-1-phosphate rises postprandially after intestinal absorption of fructose and its conversion to fructose-1-phosphate by liver fructokinase.
Conversely, inhibition of GCK by fructose-6-phosphate liganded toGCKR would provide a mechanism for indirect negative feedback, since fructose 6- phosphate is in equilbrium with glucose 6-phosphate (the product of the GCK reaction) through the phosphohexose isomerase step of glycolysis [18].
The conformational state of GCK preferred for binding to GCKR is the super-open form. This was
suggested by experiments in a cell-free assay with purified proteins, in which the association of GCK with GCKR was estimated by co-immunoprecipitation. The amount of GCK associated with GCKR was reduced under conditions favoring the closed conformational state of GCK, that is during incubation at elevated glucose concentrations in the presence of ATP, or in the presence of glucose together with a small molecule activator of GCK. This suggested that the interface for binding toGCKRwould be disrupted by the conformational transition from the super-open to the closed forms of GCK [19].
The reversible association of GCK with GCKR does more than simply regulate the catalytic activity of GCK, it also appears to underlie the intracellular trafficking ofGCKbetween cytoplasm and nucleus. In transfected rat hepatocytes, GCK tagged with green fluorescent protein was localized in the nucleus at low glucose and was released to the cytoplasm at high glucose, but GCK mutants with reduced affinity for GCKRwere predominantly cytoplasmic at low as well as high glucose [20]. In cell lines devoid of GCK and GCKR, such as COS-1, HeLa and HEK293T cells, forced expression of GCK alone resulted in cytoplasmic localization, whereas co-expression with GCKR
resulted in nuclear accumulation of both proteins [20 – 22]. In a rat islet b-cell line with no endogenous GCKR, doxycycline-inducible expression of GCKR resulted in nuclear accumulation of GCKR together with translocation of endogenous GCK from an extranuclear localization to the nuclei [22].
A model (Fig. 1) to account for these results proposes that GCKR in the free state would shuttle between nucleus and cytoplasm. Under low glucose conditions, the assembly of GCKR-GCK complex would result in nuclear import and trapping of both proteins by molecular mechanisms not yet completely elucidated. Masking of a nuclear export sequence (NES) between amino acids 300 and 310 of GCK sequence would be part of this mechanism [21]. In metabolic states accompanied by high glucose or fructose-1-phosphate concentrations, and sufficient ATP levels [23], the
GCK-GCKR complex would dissociate and the NES
of GCK would become functional, allowing for the rapid export of GCK from nuclei. In the isolated
perfused liver system and in primary cultures of rat hepatocytes, GCK and GCKR were indeed mainly localized to the nuclei at glucose concentrations around 5 mM. Higher glucose levels or fructose addition to the medium caused a rapid translocation of GCK to a predominant cytoplasmic localization [24, 25].
This was accompanied to a lesser degree by redistribution of GCKR to the cytoplasm [26, 27]. As
predicted by this model, mice with homozygous inactivation of the GCKR gene had an extranuclear
localization of hepatic GCK under all metabolic conditions [28, 29]. Interestingly, the steady state
amount ofGCKin the liver was reduced about 50%in the GCKR knock-out animals, suggesting the possibility that the interaction with GCKR might stabilize GCK against degradation.
Recently, a minor fraction of GCK and GCKR in hepatocytes was reported to be associated with the
mitochondrial fraction, raising the suggestion of distinct pools of cytoplasmic GCK with specialized
metabolic functions [30]. However, this notion should be considered with caution, because other authors failed to detect GCK activity or immunoreactivity in isolated mouse liver mitochondria [31].
Translation - English Analisi
La Fisiologia molecolare della Glucochinasi dei Mammiferi
P. B. Iynedjian
Department of Cell Physiolgy and Metabolism, University of Geneva School of Medicine,
CMU 1 Rue Michel-Servet, 1211 Geneva 4 (Switzerland), Fax: 41 22/379 55 43,
e-mail: [email protected]
Received 11 June 2008; received after revision 18 July 2008; accepted 30 July 2008
Online First 26 August 2008
Compendio. Il gene della glucochinasi (GCK) è stato uno dei primi geni candidati ad essere identificati come un “gene del diabete” umano. Di conseguenza, sono stati fatti importanti passi avanti nel capire l’ impatto di GCK (la glucochinasi) nella regolazione del metabolismo del glucosio. L’osservazione della struttura attraverso la cristallografia ha fornito un’intuizione nelle proprietà cinetiche di GCK. Sono stati scoperti partner di interazione proteica di GCK. Gli studi sull’espressione del gene hanno rivelato nuovi aspetti della distribuzione tessutale di GCK, incluso nel cervello, e la sua regolazione attraverso l’insulina nel fegato. L’analisi del controllo metabolico associata all’iperespressione del gene ed agli esperimenti di knockout hanno messo in evidenza l’impatto unico della glucochinasi (GCK) come un regolatore del metabolismo del glucosio. I mutanti della glucochinasi (GCK) umana sono stati studiati biochimicamente per capire i meccanismi della malattia. Programmi di sviluppo del farmaco identificarono piccoli attivatori molecolari di GCK come potenziali antidiabetici. Questi progressi sono compendiati qui, con lo scopo di offrire una prospettiva integrata del ruolo di GCK nella fisiologia molecolare e nella medicina di omeostasi del glucosio.
Parole chiave. Glucochinasi, diabete, metabolismo del glucosio, insulina, esochinasi, Isole di Langerhans, epatociti, MODY.
Introduzione
Questa analisi si concentra sull’enzima conosciuto come glucochinasi dei mammiferi. Piuttosto ironicamente, questo enzima non è realmente una glucochinasi nel senso stretto, denotando un enzima di fosforilazione del glucosio con rigorosa specificità del sottostrato per glucosio, come esiste in organismi minori. La glucochinasi dei mammiferi è capace di fosforilare esosi come il mannosio o il fruttosio oltre al glucosio, una proprietà divisa con tre altre esochinasi presente a vari livelli e in varie combinazioni nei tessuti umani, di ratto, e di topo [1].
I quattro isoenzimi dei mammiferi mostrano identità di sequenze estese, non lasciando dubbi su una stretta relazione filogenetica [2], e discutendo per la terminologia dell’esochinasi I-IV (o A -D) in cui l’esochinasi IV (o D) indica la glucochinasi dei mammiferi.
Nonostante queste considerazioni, il termine glucochinasi è diventato radicato nella tradizione, probabilmente perché trasmette un significato del ruolo veramente unico di questo enzima nella regolazione dell’omeostasi del glucosio. Questa tradizione è seguita nel corrente articolo, con l’intesa che la glucochinasi (GCK) sta per esochinasi IV (o D). Che il nome dovrebbe essere riconsiderato in futuro è una domanda aperta, perché, nei genomi umani e nel topo è stato recentmente identificato un gene che codifica una glucochinasi funzionale e ADP-dipendente memore degli organismi primitivi [3]. Il livello dell'attività e il ruolo fisiologico di questo enzima nei tessuti mammiferi è attualmente ignoto.
La glucochinasi è stata identificata come un enzima del fegato di ratto nel 1962. Nel 1992, due studi che usavano l’approccio del gene candidato riportarono un collegamento genetico tra una forma di diabete di inizio di maturità dei giovani, chiamato MODY 2, e il gene di GCK [4, 5]. Questa scoperta giunse come il culmine di tre decadi di ricerca nella biochimica, nella fisiologia e nella biologia molecolare che dimostrarono collettivamente l’espressione preferenziale di GCK negli epatociti e nelle cellule β del pancreas e suggerirono un ruolo determinante nel metabolismo del glucosio. Queste ricerche, che avevano conferito a GCK il grado di primo candidato come “il gene del diabete”, è stato l’argomento di due riviste pubblicate nel 1993 [6, 7].
Negli ultimi anni la nostra percezione del ruolo importantissimo di GCK nella regolazione del metabolismo del glucosio è stata rinforzata da importanti risultati in una varietà di aree sperimentali. Le ricerche strutturali attraverso la cristallografia a raggi X gettano nuova luce sulle cinetiche molto particolari dell’enzima di GCK. Gli studi dell’espressione del gene hanno rivelato nuovi aspetti della distribuzione tissutale di GCK, in particolare nel cervello e della regolazione di insulina dell’espressione nel fegato. Le manipolazioni genetiche nelle cellule e nei topi hanno portato ad ulteriori passi avanti nella nostra comprensione della funzione di sensore di glucosio di GCK al livello cellulare ed il suo impatto su omeostasi del glucosio di tutto il corpo. Questo articolo è stato scritto per raggruppare le informazioni tratte da linee molto diverse di investigazione, con lo scopo di offrire una prospettiva integrata dell’unico posto della glucochinasi (GCK) nella fisiologia e in medicina.
Struttura tridimensionale di GCK: cinetiche cooperative del glucosio spiegate
Il glucosio assorbito dalle cellule dei mammiferi deve essere convertito in glucosio 6-fosfato come preludio di un’ulteriore utilizzazione per la glicolisi, la via pentoso fosfato o glicogeno sintesi. Sebbene non possa essere escluso qualche contributo alla fosforilazione di glucosio totale attraverso la glucochinasi ADP- dipendente identificata recentemente [3], la maggior parte della fosforilazione del glucosio accade a spese di ATP nella reazione generica catalizzata dalle esochinasi: esoso ATP → 6-fosfato di esoso ADP (hexose ATP → hexose 6-phosphate ADP) [8].
Fra le esochinasi, GCK mostra cinetiche enzimatiche uniche in due aspetti.
Primo, GCK ha un affinità per il glucosio (S0.5 6 mM) più di 20 volte più bassa di quella del vicino grado di esochinasi, esochinasi II.
Secondo (aspetto), la velocità di reazione di GCK mostra una dipendenza da concentrazione di glucosio sigmoidea piuttosto che iperbolica [1]. Queste due proprietà cinetiche, l’affinità bassa e la cooperatività riguardo al glucosio, permettono a GCK di operare come un sensore di glucosio fisiologico ultrasensibile nelle cellule dotate di un’attività non-limitante del trasporto del glucosio alla membrana plasmatica (vedi sotto).
La cooperatività di GCK con il glucosio non può essere spiegata dai classici meccanismi di all’osteria per proteine di multi-subunità, perché GCK è cataliticamente attiva nello stato monomerico [9]. Inoltre, GCK ospita un unico sito legante di glucosio (il luogo attivo) [10], escludendo la possibilità di allosteria multi- sito nella quale due molecole di glucosio si legherebbero simultaneamente all’enzima. La deviazione dalle cinetiche iperboliche qualche volta è notata per gli enzimi monomerici in caso di somma casuale di sottostrati, ma questo non è il caso del ciclo catalitico di GCK che comporta una somma logica di sottostrati in cui si lega prima il glucosio e dopo ATP [11]. Un meccanismo di cooperatività positiva applicabile ad enzimi monomerici, chiamato il modello mnemonico, fu proposto per GCK sulla base di passate ricerche enzimologiche [12].
I pronostici dal modello mnemonico sono stati confermati dai recenti studi che usano misurazioni di stato pre-stazionario (pre-steady-state) della fluorescenza intrinseca di GCK durante (l’azione) legante del glucosio ed altri ligandi [13, 14]. Il meccanismo mnemonico di cooperatività include le caratteristiche seguenti: i) equilibrio tra due stati conformazionali di GCK con affinità di glucosio vastamente diverse; ii) grande predominanza della conformazione di bassa affinità in assenza di glucosio; iii) lenta interconversione tra gli stati conformazionali per GCK senza glucosio; iv) conversione dallo stato conformazionale di bassa affinità allo stato conformazionale ad alta affinità accelerata fortemente quando il glucosio si lega a GCK; v) solamente il modulo di elevata affinità dell'enzima è cataliticamente competente, e la velocità dei passaggio catalitici è
molto alta comparata alla velocità di transizione conformazionale.
Un supporto chiaro per il modello recentemente giunse da dati strutturali sulla glucochinasi (GCK) umana ottenuto da Kamata e colleghi che risolsero la struttura di GCK attraverso la cristallografia a raggio X [15]. I Cristalli furono ottenuti da GCK con dei corti troncamenti alla fine di NH2-terminale (11 o 15 amino acidi) sotto due condizioni di cristallizzazione distinte: in presenza di glucosio più un piccolo attivatore molecolare di GCK (vedi sotto), o in assenza di qualsiasi ligando. La struttura globale della proteina comprendeva un dominio globulare grande ed uno piccolo connessi da una cerniera fatto di tre anelli flessibili. Con il glucosio e l’attivatore presenti, lo spazio tra i due domini hanno assunto la forma di una fenditura stretta, profonda che contiene la tasca legante il glucosio. Il sito legante per l’attivatore è stato localizzato anche nella regione della cerniera, ad una distanza dalla tasca legante del glucosio. La struttura era molto simile a quella della metà dell’esochinasi C terminale I cristallizzata in presenza di glucosio, chiamata forma chiusa di esochinasi, e fu designata perciò il modulo “chiuso” di GCK. Al contrario, i cristalli di GCK formati senza ligandi hanno mostrato la conformazione definita “super-open” (super aperta). In questa configurazione, lo spazio di fenditura tra i due domini di GCK era molto più largo, come risultato di due cambi conformazionali comparato al modulo chiuso: inclinazione e rotazione del piccolo dominio rispetto al grande dominio, e riordinamento esteso degli elementi strutturali e secondari del piccolo dominio stesso [15].
Le due strutture di GCK ai raggio X potrebbero facilmente essere adattati al modello mnemonico del meccanismo dell’enzima. La conformazione super-aperta rappresenta l’affinità di glucosio lieve, cataliticamente la forma inattiva dell’enzima. La conformazione chiusa corrisponde alla forma di affinità elevata di GCK con glucosio ed ATP legati nel sito attivo durante la catalisi. Una conformazione supplementare di GCK, intermediaria tra gli stati super-aperti e quelli chiusi è stata presupposta per il modulo di affinità alto dell'enzima libero da sottostrati o prodotti. Questa conformazione putativa è stata designata la forma “aperta”. La struttura cristallina di GCK nella forma aperta rimane da stabilire. Comunque, gli studi della diffrazione dei raggi X dei cristalli della metà dell’esochinasi I C-terminale formata in assenza di glucosio possono servire da modello per il modulo aperto. Il modulo aperto, comparato al modulo chiuso, ha mostrato una fenditura di interdominio più larga dovuta ad una lieve curva del piccolo dominio relativo al grande dominio, senza cambio nella topologia interna nel centro del piccolo dominio [16].
La transizione tra la conformazione aperta e quella chiusa sarebbero molto veloci e facilmente invertibili, al contrario della riorganizzazione molecolare più complessa interessata nella transizione lenta dalle conformazioni super aperte a quelle conformazioni aperte. Effettivamente, la previsione di uno stato aperto ed intermedio di GCK è stato confermato in un recente studio che usa la simulazione di dinamiche molecolari e designata come bersaglio per sezionare la transizione dalle configurazioni chiuse alle configurazioni di GCK super-aperte [17].
Regolazione dell'attività della glucochinasi attraverso l’interazione di proteina-proteina
Interazione con la proteina regolatrice la glucochinasi epatica. Il meccanismo meglio compreso della rapida regolazione dell’attività di GCK dipende dall’interazione di proteina-proteina tra GCK ed un partner chiamato proteina regolatrice della glucochinasi (GCKR). L'associazione tra le due proteine è ligando- dipendente e inibitrice l’attività di GCK. I ligandi per GCKR sono fruttosio-6-fosfato e fruttosio-1-fosfato, che sono reciproci concorrenti. Il legame di fruttosio 6 - fosfato a GCKR favorisce l’interazione di GCKR-GCK con un effetto negativo sull’attività dell’enzima, mentre il legame di fruttosio-1-fosfato indebolisce l’interazione di GCKR GCK e rilascia GCK attivo. Il fruttosio-1-fosfato intra-epatico aumenta in modo post-prandiale dopo l’assorbimento intestinale di fruttosio e la sua conversione in fruttosio-1-fosfato da fruttochinasi del fegato.
Al contrario, l’inibizione di GCK causata da fruttosio-6-fosfato legato a GCKR procurerebbe un meccanismo per reazione negativa ed indiretta, poiché il fruttosio 6 - fosfato è in equilibrio con 6-fosfato di glucosio (il prodotto della reazione di GCK) attraverso la fase fosfoesoso isomerasi della glicolisi [18].
Lo stato conformazionale di GCK preferito per legarsi a GCKR è il modulo super-aperto. Ciò è stato suggerito da esperimenti in una prova senza cellule (cell-fre) con proteine purificate in cui l’associazione di GCK con GCKR è stata valutata attraverso la co-immunoprecipitazione. La quantità di GCK associata a GCKR fu ridotta sotto condizioni che favoriscono lo stato conformazionale chiuso di GCK che è durante l’incubazione a concentrazioni di glucosio elevate in presenza di ATP o in presenza di glucosio insieme ad un piccolo attivatore molecolare di GCK. Questo suggerì che l’interfaccia per legarsi a GCKR sarebbe stata disgregata attraverso la transizione conformazionale dai moduli super-aperto ai moduli chiusi di GCK [19].
L’associazione reversibile di GCK con GCKR fa più che regolare semplicemente l’attività catalitica di GCK, sembra anche essere alla base dello scambio intracellulare di GCK tra il citoplasma e tra il nucleo. Negli epatociti di ratto trasfetti, GCK evidenziata con la proteina fluorescente verde è stata localizzata nel nucleo a basso quantità di glucosio, ed è stata liberata al citoplasma ad elevata quantità di glucosio, ma i mutanti di GCK con ridotta affinità per GCKR erano prevalentemente citoplasmatici sia a bassa quantità così come ad elevate quantità di glucosio [20]. Nelle linee della cellula prive di GCK e GCKR, come COS-1, HeLa e le cellule di HEK293T , la sola espressione forzata di GCK ha portato alla localizzazione citoplasmatica, dal momento che la co-espressione con GCKR ha portato all’accumulazione nucleare di entrambe le proteine [20-22]. In una linea dell’isola delle beta cellule di ratto senza GCKR endogeno, l’espressione doxiciclina- inducibile di GCKR ha portato all’accumulazione nucleare di GCKR insieme al trasferimento di GCK endogena da una localizzazione extranucleare ai nuclei [22].
Un modello (Fig. 1) per spiegare questi risultati suggerisce che GCKR nello stato libero farebbe da spola tra il nucleo e il citoplasma. Sotto condizioni di glucosio basso, l’assemblaggio del complesso di GCKR-GCK risulterebbe nell’importazione nucleare e nell’incastro di entrambe le proteine dai meccanismi molecolari non ancora completamente delucidati. Mascherare una sequenza di esportazione nucleare (NES) tra aminoacidi 300 e 310 della sequenza di GCK sarebbe parte di questo meccanismo [21]. In stati metabolici accompagnati da glucosio alto o concentrazioni di fruttosio-1-fosfato, e sufficienti livelli di ATP [23], il complesso di GCK-GCKR si dissocerebbe ed il NES
di GCK diverrebbe funzionale, permettendo la rapida esportazione di GCK dai nuclei. Nell’isolato e perfuso sistema del fegato e nelle culture basilari di epatociti del ratto, GCK e GCKR infatti furono localizzati principalmente nei nuclei a concentrazioni di glucosio di circa 5 mM. Livelli di glucosio più alti della media o un aggiunta maggiore di fruttosio provocò un trasferimento rapido di GCK ad una localizzazione citoplasmatica predominante [24, 25].
Questo fu accompagnato ad un grado minore dalla ridistribuzione di GCKR al citoplasma [26, 27]. Come previsto da questo modello, i topi con l’inattivazione omozigote del gene GCKR avevano una localizzazione extranucleare di GCK epatico sotto tutte le condizioni metaboliche [28, 29]. In modo interessante, la somma dello stato stazionario di GCK nel fegato fu ridotto approssimativamente del 50% negli animali knock-out GCKR, suggerendo la possibilità che è probabile che l’interazione con GCKR stabilizzi GCK contro la regressione.
Recentemente, una frazione minore di GCK e GCKR negli epatociti fu riferito essere associata alla frazione mitocondriale, sollevando il suggerimento di distinti gruppi di GCK citoplasmatico con specializzate funzioni metaboliche [30]. Comunque, questa nozione dovrebbe essere considerata con cautela, perché altri autori non riuscirono a scoprire l’attività di GCK o immunoreattività in mitocondri di fegato di topo isolati [31].
Italian to Spanish: Frente a una Nueva Era... Desafío a la pastoral en el horizonte de la Nueva Evangelización General field: Art/Literary Detailed field: Religion
Source text - Italian Frente a una Nueva Era...
Desafío a la pastoral en el horizonte de la Nueva Evangelización
Presentación
Las Conclusiones de Santo Domingo han resaltado la urgencia de una acción pastoral, capaz de concretar la Nueva Evangelización, la promoción humana y la inculturación de la fe.
Desde hace algún tiempo y cada vez con mayor intensidad, está presente entre nosotros uno de los fenómenos relevantes de la llamada “cultura postmoderna”: la nueva religiosidad.
Al concluir la X Semana Argentina de Teología, dedicada a la “Cristología ante el desafío del secularismo”, la Sociedad Argentina de Teología (SAT) nos hizo llegar su viva inquietud “dada la importancia que está cobrando este fenómeno… y sus consecuencias por la distorsión de la religiosidad”.
Cabe reconocer que de formas nuevas, están creciendo los dos principales desafíos señalados en las “Líneas Pastorales para la Nueva Evangelización”: el secularismo y la injusticia (LPNE 11-14).
En efecto, en este fenómeno unido a una expandida sed de religiosidad, el secularismo se hace presente al diluírse —en las conciencias— la realidad del misterio del Dios vivo y de su trascendencia. A su vez, la injusticia se ve favorecida por el énfasis unilateral puesto en el sentimiento y en la percepción experiencial subjetiva, con un notorio desentendimiento de la búsqueda del “bien común”, aislándose —casi exlusivamente— en el afán de bienestar individual y decreciendo en la solidaridad.
Entre nosotros, la expresión más difundida de la nueva religiosidad es el fenómeno de la “Nueva Era” (New Age) o “Era de Acuario”, que se está constituyendo en un gran desafío cultural a la Nueva Evangelización. Realidad que exige de los pastores y de los agentes evangelizadores: lúcido discernimiento, serena clarificación doctrinal y acertada creatividad pastoral, para responder evangélicamente al nuevo fenómeno cultural. Tareas que habríamos de llegar a compartir con los hermanos cristianos pertenecientes a las iglesias históricas, aún separadas.
Para ayudar a este objetivo —dentro del horizonte de las “Líneas Pastorales para la Nueva Evangelización” y las Conclusiones de la IV Conferencia realizada en Santo Domingo— la Comisión Permanente de la CEA nos ha solicitado la elaboración y publicación del subsidio que presentamos.
Agradecemos particularmente a Mons. Luis H. Rivas, Presidente de la Sociedad Argentina de Teología, al R.P. Juan C. Meinvielle sdb y al Pbro. Oscar Gerometta, por su paciente colaboración en las tareas de redacción y revisión.
Que el Espíritu Santo nos conceda el don de sabiduría para discernir y la fervorosa audacia evangelizadora que necesitamos a fin de “satisfacer el hambre de Dios mediante el pan de la Palabra y la sed de justicia con la promoción más íntegra de la dignidad humana” (LPNE32).
Octava de Pascua de 1993
Comisión Episcopal de Fe y Cultura
Translation - Spanish Di fronte ad una Nuova Era…
Sfida alla pastorale all’orizzonte della Nuova Evangelizzazione
Presentazione
Le Conclusioni di Santo Domingo hanno messo in evidenza l’urgenza di una nuova azione pastorale, capace di realizzare la Nuova Evangelizzazione, la promozione umana e l’inculturazione della fede.
Da qualche tempo e sempre con maggiore intensità, è presente tra noi uno dei fenomeni rilevanti della cosiddetta “cultura postmoderna”: la nuova religiosità.
A conclusione della X Settimana Argentina di Teologia, dedicata alla “Cristologia di fronte alla sfida del secolarismo”, la Società Argentina di Teologia (SAT) ci ha fatto sentire la sua profonda inquietudine “data l’importanza che sta guadagnando questo fenomeno… e le sue conseguenze per lo stravolgimento della religiosità” .
Si deve riconoscere che stanno crescendo, in maniera insolita, le due principali sfide segnalate nelle “Linee Pastorali per la Nuova Evangelizzazione”: il secolarismo e l’ingiustizia (LPNE 11-14).
Effettivamente, in questo fenomeno congiunto ad una diffusa sete di religiosità, il secolarismo si fa presente quando - nelle coscienze- si stempera la realtà del mistero di Dio vivo e della sua trascendenza. A sua volta, l’ingiustizia si vede favorita dall’enfasi unilaterale posta nel sentimento e nella percezione dell’esperienza soggettiva, con un notorio disinteressamento della ricerca del “bene comune”, isolandosi – quasi esclusivamente – nell’ansia del benessere individuale e decrescendo nella solidarietà.
Fra noi, l’espressione più diffusa della nuova religiosità è il fenomeno della New Age o “Era dell’Acquario”, che si sta formando come una grande sfida culturale alla Nuova Evangelizzazione. Realtà che esige dai pastori e dagli agenti evangelizzatori: un lucido discernimento, una serena chiarificazione dottrinale e un’accertata creatività pastorale, per rispondere con il vangelo al nuovo fenomeno culturale. Compiti che dovremmo riuscire a condividere con i fratelli cristiani appartenenti alle chiese storiche, ancora separate.
Per sostenere questo obiettivo – nell’orizzonte delle “Linee pastorali per la Nuova Evangelizzazione” e le Conclusioni della IV Conferenza realizzata a Santo Domingo – La Commissione Permanente della CEA ci ha richiesto l’elaborazione e la pubblicazione del sussidio che presentiamo.
Ringraziamo particolarmente Monsignor Luis H. Rivas, Presidente della Società Argentina di Teologia. Il R. P. Juan C. Meinveille e Oscar Gerometta, per la sua paziente collaborazione negli impegni di redazione e di revisione.
Che lo Spirito Santo ci conceda il dono della saggezza per ravvisare sia la fervorosa audacia evangelizzatrice di cui abbiamo bisogno al fine di “soddisfare la fame di Dio mediante il pane della Parola sia la sete di giustizia con la promozione più integra della dignità umana” (LPNE 32).
Ottava di Pasqua del 1993
Commissione Episcopale della Fede e Cultura
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Master's degree - Università degli studi di Messina
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Bio
La mia formazione scolastica ed universitaria è caratterizzata dallo studio delle lingue, poiché ho conseguito la maturità linguistica ed ho proseguito i miei studi alla facoltà di Lingue e Letterature Straniere (specialista lingua inglese, seconda lingua spagnolo).
La tesi di laurea con la quale ho concluso la carriera universitaria trae spunto dalla bizzarra ipotesi che William Shakespeare fosse messinese, teoria che contesto con la mia ricerca.
Ho conseguito la qualifica professionale di Traduttore in lingue Inglese e Francese.
Ho esperienza in traduzioni di testi (universitari, scolastici, di narrativa), di vari generi: medico, giuridico, turistico....
La professione di traduttore mi permette, nello svolgimento delle versioni, di acquisire conoscenze che vanno aldilà della mia specializzazione, ecco perchè amo questo lavoro!
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