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Affiliations
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English to Spanish: Translation of a biomedical patent. General field: Medical Detailed field: Biology (-tech,-chem,micro-)
Source text - English Broad spectrum Erbb ligand binding molecules and methods for their use.
BACKGROUND
Receptor tyrosine kinases are involved in stimulating the growth of many cancers. In general, receptor tyrosine kinases are glycoproteins which consist of (1) an extracellular domain that can bind with a specific ligand, (2) a transmembrane region, (3) a juxtamembrane domain which may regulate the receptor activity by, for instance, protein phosphorylation, (4) a tyrosine kinase domain that is the enzymatic component of the receptor, and (5) a carboxyterminal tail. The ErbB family of type I receptor tyrosine kinases constitute an important class of such receptors because of their importance in mediating cell growth, differentiation and survival in many solid tumors. Members of this receptor family include ErbB1 (also known as HER1), ErbB2 (HER2/neu), ErbB3 (HER3), and ErbB4 (HER4). More than a dozen ligands interact with the ErbB-family receptors. For example, EGF, Transforming Growth Factor α (TGFα), and amphiregulin all bind to ErbB1. Isoforms of neuregulin, also known as Heregulin and Neu Differentiation Factor (NDF) have specific affinity for ErbB3 and ErbB4. Ligands such as betacellulin, heparin-binding EGF and epiregulin bind to both ErbB1 and ErbB4.
It is becoming clear that over expression of ErbB activating ligands can cause an uncontrolled cellular proliferation disease state similar to that of a deregulated receptor. In such cases, interference with the binding of the activating ligand to its receptor may provide an effective therapeutic strategy or could accentuate current receptor based or other therapies. Binding molecules that can trap and sequester the full spectrum of ErbB ligands may be of even more use in the treatment of cancer.
Several therapeutics exist that have attempted this trapping or “decoy” strategy. For example, Enbrel™ (etanercept—Amgen) is a soluble, modified version of the TNFR receptor that binds and traps the pro-inflammatory ligand TNFα. In addition, a soluble fusion protein of the VEGFRI and VEGFR2 receptors, called EYLEA™, has been approved for the treatment of macular degeneration and is under investigation for use in the treatment of several forms of cancer (Regeneron Pharmaceuticals). An ErbB3 trap has also shown potency in vitro at enhancing the effects of a dual EGFR/ErbB2 inhibitor and reversed GW2974 (a small molecule inhibitor of ErbB 1 and ErbB2) resistance in cells treated with NDF.
All currently approved ErbB inhibitors target either EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 or combinations of all 4 proteins. However, no therapeutic is known that interferes with the binding of ligands to multiple ErbB receptors simultaneously. Thus, new binding molecules are needed that can be used to sequester receptor ligands, such as ErbB ligands, and thereby block ligand binding to multiple ErbB receptors and subsequent receptor activation. Binding molecules capable of binding ligands to more than ErbB 1 or ErbB4 receptors and ideally all known ErbB ligands and that are accompanied by a minimal immune response would be particularly useful.
A number of binding studies have been carried out to determine regions of ErbB3 that are important to the binding of its ligand, heregulin. Singer, et. al. (2001), J. Biol. Chem. 276, 44266-44274. Other studies using chimeric receptors have identified the relative contributions of the extracellular domains of ErbB 1 and ErbB4 to ligand-specific signaling. Kim, et. al. (2002), Eur. J. Biochem. 269, 2323-2329. These studies reveal that neuregulin binding to ErbB4 depends much more on domain I than on domain III and that domain III of ErbB 1 is primarily important for EGF binding. However, these studies were conducted on full length receptors which span the entire length of the receptors including the transmembrane and cytoplasmic domains. These large molecules present manufacturing and administration problems potentially leading to lower therapeutic efficacy.
SUMMARY OF INVENTION
A chimeric ErbB ligand binding molecule is disclosed along with its pharmaceutically acceptable salt forms. The molecule is a protein that as part of its sequence includes the sequence of SEQ ID NOS: 1, 2, or 3. The molecule can be fused to an IgGFc and especially IgGFc containing cysteine to serine changes in the hinge region. For example, the fusion can be to IgG1Fc DNA sequences that encode the binding molecules are also contemplated as well as vectors containing such DNA sequences and hosts that contain such vectors. Pharmaceutical compositions are contemplated that contain the binding molecule along with a pharmaceutically acceptable excipient.
Methods for treating a patient having a cancer that is sensitive to one or more ErbB ligands are also contemplated. Such methods can involve administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition that contains the chimeric ErbB ligand binding molecule.
FIGURES
FIG. 1 provides a graphical representation of the decrease in p-EGFR expression as the concentration of LC010 increases.
FIG. 2 provides a graphical representation of the inhibition of p-EGFR in which the IC50 was calculated.
FIG. 3 provides a graphical analysis of the decrease in p-ErbB3 expression of McF7 cells when treated with HRG1B in response to increasing LC010.
FIG. 4 provides a graphical analysis of the inhibition shown in FIG. 3 in which the IC50 was calculated.
FIG. 5 provides a graphical analysis of the inhibition shown in FIG. 4 with the inhibition by Trap 6 in an identical experiment.
DETAILED DESCRIPTION OF INVENTION
For purposes of this disclosure the term “homology” is intended to mean a region of amino acid sequence having identical or conservative amino acid substitutions as that term is generally understood in the art.
All of the amino acid numbering in this application is intended to be exclusive of the native signal peptide.
A chimeric ErbB embodiment has been developed in which amino acids 1-249 from ErbB4, SEQ ID NO. 1 below, are fused to amino acids 253-501 from ErbB1, SEQ ID NO. 2 below, as shown in SEQ ID NO.: 3. The fusion points described above for ErbB4 and ErbB1 were specifically chosen to reduce the immunogenicity of the chimeric protein. Glutamine 126 in the ErbB4 sequence can be changed to an asparagine to increase the binding affinity for ErbB 1 specific ligands.
In certain embodiments the ErbB chimera can be fused with components that cause aggregative conjugate formation or to extend protein half-life. For example, the ErbB chimera can be fused to the constant region of immunoglobulin molecule such as the Fc region of IgG. For purposes of this disclosure one suitable Fc region is IgG2Fc. Another is IgG1Fc. Others are also known in the art and can be used. In certain embodiments the moiety can contain mutations that reduce the tendency of the Fc to dimerize. This can include substitutions of serine in place of cysteine at positions 226 and 229 of the IgG2Fc moiety, for example.
[TABLE-US-00001]
SEQ. ID. NO. 1
Q S V C A G T E N K L S S L S D L E Q Q Y R A L R K Y Y E N C E V V M G N L E I T S I
E H N R D L S F L R S V R E V T G Y V L V A L N Q F R Y L P L E N L R I I R G T K L Y
E D R Y A L A I F L N Y R K D G N F G L Q E L G L K N L T E I L N G G V Y V D N N K F
L C Y A D T I H W Q D I V R N P W P S N L T L V S T N G S S G C G R C H K S C T G R C
W G P T E N H C Q T L T R T V C A E Q C D G R C Y G P Y V S D C C H R E C A G G C S
G P K D T D C F A C M N F N D S G A C V T Q C P Q T F V Y N P T T F Q
SEQ. ID. NO. 2
M D V N P E G K Y S F G A T C V K K C P R N Y V V T D H G S C V R A C G A D S Y E
M E E D G V R K C K K C E G P C R K V C N G I G I G E F K D S L S I N A T N I K H F K
N C T S I S G D L H I L P V A F R G D S F T H T P P L D P Q E L D I L K T V K E I T G F L
L I Q A W P E N R T D L H A F E N L E I I R G R T K Q H G Q F S L A V V S L N I T S L G
L R S L K E I S D G D V I I S G N K N L C Y A N T I N W K K L F G T S G Q K T K I I S N
R G E N S C K A T G Q V C H A L C S P E G C W G P E P R D C V S
The sequence of the chimera with a signal sequence (M E W S W V F L F F L S V T T G V H S) included is set out below:
[TABLE-US-00002]
SEQ ID NO. 3
M E W S W V F L F F L S V T T G V H S Q S V C A G T E N K L S S L S D L E Q Q Y R A
L R K Y Y E N C E V V M G N L E I T S I E H N R D L S F L R S V R E V T G Y V L V A L
N Q F R Y L P L E N L R I I R G T K L Y E D R Y A L A I F L N Y R K D G N F G L Q E L
G L K N L T E I L N G G V Y V D N N K F L C Y A D T I H W Q D I V R N P W P S N L T L
V S T N G S S G C G R C H K S C T G R C W G P T E N H C Q T L T R T V C A E Q C D G
R C Y G P Y V S D C C H R E C A G G C S G P K D T D C F A C M N F N D S G A C V T Q
C P Q T F V Y N P T T F Q M D V N P E G K Y S F G A T C V K K C P R N Y V V T D H G
S C V R A C G A D S Y E M E E D G V R K C K K C E G P C R K V C N G I G I G E F K D
S L S I N A T N I K H F K N C T S I S G D L H I L P V A F R G D S F T H T P P L D P Q E L
D I L K T V K E I T G F L L I Q A W P E N R T D L H A F E N L E I I R G R T K Q H G Q F
S L A V V S L N I T S L G L R S L K E I S D G D V I I S G N K N L C Y A N T I N W K K L
F G T S G Q K T K I I S N R G E N S C K A T G Q V C H A L C S P E G C W G P E P R D C
V S
Trap 6 is identical to LC010 with the exception of an Asparagine at position 126. Its sequence is provided with SEQ is No. 4 below:
[TABLE-US-00003]
SEQ ID NO. 4
Q S V C A G T E N K L S S L S D L E Q Q Y R A L R K Y Y E N C E V V M G N L E I T S I
E H N R D L S F L R S V R E V T G Y V L V A L N Q F R Y L P L E N L R I I R G T K L Y
E D R Y A L A I F L N Y R K D G N F G L Q E L G L K N L T E I L N G G V Y V D Q N K F
L C Y A D T I H W Q D I V R N P W P S N L T L V S T N G S S G C G R C H K S C T G R C
W G P T E N H C Q T L T R T V C A E Q C D G R C Y G P Y V S D C C H R E C A G G C S
G P K D T D C F A C M N F N D S G A C V T Q C P Q T F V Y N P T T Y Q M D V N P E G
K Y S F G A T C V K K C P R N Y V V T D H G S C V R A C G A D S Y E M E E D G V R K
C K K C E G P C R K V C N G I G I G E F K D S L S I N A T N I K H F K N C T S I S G D L
H I L P V A F R G D S F T H T P P L D P Q E L D I L K T V K E I T G F L L I Q A W P E N
R T D L H A F E N L E I I R G R T K Q H G Q F S L A V V S L N I T S L G L R S L K E I S
D G D V I I S G N K N L C Y A N T I N W K K L F G T S G Q K T K I I S N R G E N S C K
A T G Q V C H A L C S P E G C W G P E P R D C V S
The chimeric ErbB binding molecule of SEQ ID NO.: 3 was fused to IgG2Fc having serine in place of cysteine at positions 226 and 229 on the Fc moiety (LC010) and the resulting protein was isolated. The ability of the molecule to inhibit the growth of A431 cells in the presence of added TGFα was investigated and is shown. Briefly, A431 cells were either treated with different concentrations of LC010 (62.5 to 500 nM) for 2 hrs or untreated. After 2 hrs, the cells were treated with 12.5 ng/mL of TGFα for 10 min Cell lysates were collected and analyzed for EGFR activation with a p-EGFR ELISA assay. The graph in FIG. 1 shows the decrease in p-EGFR expression with increasing concentration of LC010. Results of 2 independent experiments are shown in FIG. 1.
The IC50 of LC010 inhibition of p-EGFR was plotted and is shown in FIG. 2. The IC50 for LC010 in two experiments was calculated to be 0.6323 nM and 0.00173 nM.
The chimeric ErbB binding molecule of SEQ ID NO.: 3 was fused to IgG2Fc having serine in place of cysteine at positions 226 and 229 on the Fc moiety (LC010) and the resulting protein was isolated. The ability of the molecule to inhibit the growth of MCF7 cells in the presence of added HRG1β was investigated and is shown in FIG. 3. Briefly, MCF7 cells were either treated with different concentrations of LC010 (62.5 to 500 nM) for 1 hr or untreated. After 1 hour the cells were treated with 12.5 ng/mL of HRG1β for 10 min. Cell lysates were collected and analyzed for ErbB3 activation with a p-ErbB3 ELISA assay. The graph in FIG. 3 shows the decrease in p-ErbB3 expression with increasing concentration of LC010. Results of 2 independent experiments are shown.
The IC50 of LC010 inhibition of p-ErbB3 was plotted and shown in FIG. 4. The IC50 for LC010 is in the nanomolar range. In two experiments the IC50 was calculated to be 0.06725 and 0.1619 nM.
The IC50 of LC010 inhibition of p-ErbB3 was plotted along with the IC50 of Trap 6 (LC006) inhibition of p-ErbB3 for comparison and shown in FIG. 5.
Substitutions can be introduced into the amino acid sequence for a variety of purposes. For example, the DNA sequence for the chimeric binding molecule can be changed to remove cysteines so that the formation of aggregates through cysteine-cysteine bonds can be avoided. Substitutions of amino acids in one subdomain can be used to modify ligand binding affinities. For example, an amino acid from ErbB1 can be substituted into the ErbB4 LI subdomain to make that domain's sequence more like that of ErbB 1 in order to modify the affinity of the molecule to ErbB ligands. Similarly, amino acid substitutions from ErbB4 LII subdomains can be included into the ErbB 1 subdomain. Such substitutions can also be made in the SI and SII subdomains. Although any number of such substitutions can be considered substitutions of glutamine from ErbB 1 for serine in the ErbB4 portion at position 13, tyrosine for serine at position 42, arginine for tyrosine at position 123 are representative examples. Other examples can be identified by one of skill in the art simply by comparing sequences. Substitutions that are not homologous can also be considered. For example, asparagine could be substituted for serine at position 13 rather than the glutamine found in ErbB 1 or a residue that has intermediate characteristics of the residues found in both receptors may be used.
In addition to the Fe portion of IgG2, the chimeric ErbB protein could also be fused to other molecules or portions thereof including: other chimeric receptors (of any growth factor receptor family) or to sequences that facilitate purification of the product. The DNA sequences encoding the fusion proteins can be obtained from commercial sources and placed in any suitable expression vector and expressed from suitable hosts of which many are known.
DNA that encodes the chimeric ErbB ligand binding molecule sequences is also contemplated. One of skill can appreciate that the genetic code can be used to prepare suitable DNA sequences and codon preferences for specific expression hosts can also be incorporated into such sequences. Also contemplated for use with these sequences are additional DNA sequences that can be used for the expression of these DNA sequences. A variety of these are known. As is well known in the art such sequences can also be introduced into host cells for the maintenance of the DNA and for its expression and such hosts that include these DNA sequences are also contemplated.
Pharmaceutical compositions comprising a disclosed chimeric ErbB ligand binding molecule are also contemplated. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of a chimeric ErbB ligand binding molecule, and a pharmaceutically acceptable carrier. The term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory agency of the Federal or a state government or listed in the U.S. Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in animals, and more particularly, in humans. The term “carrier” refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle in which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like in which the chimeric ErbB ligand binding molecule is soluble and is chemically stable. The composition can also contain wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. Pharmaceutically acceptable carriers include other ingredients for use in formulations such as DPPC, DOPE, DSPC and DOPC. Natural or synthetic surfactants may be used. PEG may be used (even apart from its use in derivatizing the protein or analog). Dextrans, such as cyclodextran, may be used. Cellulose and cellulose derivatives may be used. Amino acids may be used, such as use in a buffered formulation. Pharmaceutically acceptable diluents include buffers having various contents (e.g., Tris-HCl, acetate, phosphate), pH and ionic strength; additives such as detergents and solubilizing agents (e.g., Polysorbate 80), anti-oxidants (e.g., ascorbic acid, sodium metabisulfite), preservatives (e.g., benzyl alcohol) and bulking substances (e.g., lactose, mannitol); incorporation of the material into particulate preparations of polymeric compounds such as polylactic acid, polyglycolic acid, etc. or into liposomes. Hyaluronic acid may also be used, and this may have the effect of promoting sustained duration in the circulation. Such compositions may influence the physical state, stability, rate of in vivo release, and rate of in vivo clearance of the present proteins and derivatives. See, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) pages 1435-1712 which are herein incorporated by reference. The compositions may be prepared in liquid form, or may be in dried powder, such as lyophilized form Implantable sustained release formulations are also contemplated, as are transdermal formulations. Liposome, microcapsule or microsphere, inclusion complexes, or other types of carriers are also contemplated.
The amount of the active chimeric binding molecule that will be effective for its intended therapeutic use can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays may optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. Generally, the daily regimen should be in the range of 0.1-1000 micrograms of the active agent (API) kilogram of body weight, preferably 0.1-150 micrograms per kilogram. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or suitable animal model test systems. Dosage amount and interval may be adjusted individually to provide plasma levels of the compounds that are sufficient to maintain therapeutic effect. In cases of local administration or selective uptake, the effective local concentration of the compounds may not be related to plasma concentration. The dosage regimen involved in a method for treatment can be determined by the attending physician, considering various factors which modify the action of drugs, e.g. the age, condition, body weight, sex and diet of the patient, the severity of disease, time of administration and other clinical factors.
The amount of compound administered will, of course, be dependent on the subject being treated, on the subject's weight, the severity of the affliction, the manner of administration, and the judgment of the prescribing physician. The therapy may be repeated intermittently while symptoms are detectable or even when they are not detectable. The therapy may be provided alone or in combination with other drugs.
The fusion protein of the invention can be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with free amino groups such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc., and those formed with free carboxyl groups such as those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxides, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylamino ethanol, histidine, procaine, etc.
Furthermore, aqueous compositions useful for practicing the methods of the invention have physiologically compatible pH and osmolality. One or more acceptable pH adjusting agents and/or buffering agents can be included in a composition of the invention, including acids such as acetic, boric, citric, lactic, phosphoric and hydrochloric acids; bases such as sodium hydroxide, sodium phosphate, sodium borate, sodium citrate, sodium acetate, and sodium lactate; and buffers such as citrate/dextrose, sodium bicarbonate and ammonium chloride. Such acids, bases, and buffers are included in an amount required to maintain pH of the composition in an acceptable range. One or more acceptable salts can be included in the composition in an amount sufficient to bring osmolality of the composition into an acceptable range. Such salts include those having sodium, potassium or ammonium cations and chloride, citrate, ascorbate, borate, phosphate, bicarbonate, sulfate, thiosulfate or bisulfite anions.
The amount of the fusion protein that will be effective for its intended therapeutic use can be determined by standard clinical techniques based on the present description. In addition, in vitro assays may optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. Generally, suitable dosage ranges for intravenous administration are generally about 50-5000 micrograms of active compound per kilogram body weight. Suitable dosage ranges for intranasal administration are generally about 0.01 pg/kg body weight to 1 mg/kg body weight. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.
Dosage amount and interval may be adjusted individually to provide plasma levels of the compounds that are sufficient to maintain therapeutic effect. In cases of local administration or selective uptake, the effective local concentration of the compounds may not be related to plasma concentration. One having skill in the art will be able to optimize therapeutically effective local dosages without undue experimentation.
The amount of compound administered will, of course, be dependent on the subject being treated, on the subject's weight, the severity of the affliction, the manner of administration, and the judgment of the prescribing physician. The therapy may be repeated intermittently while symptoms are detectable or even when they are not detectable. The therapy may be provided alone or in combination with other drugs.
A method for treating a patient in need of treatment is disclosed that includes obtaining a chimeric ErbB ligand binding molecule that binds ErbB ligands and interferes with the interaction and effect of ligands on the ErbB receptor system of cancer cells, and administering a therapeutically effective amount of the molecule to a patient. Administration can be by parenteral routes such as i.v. administration, direct injection into a solid tumor such as through a syringe or catheter or by i.p. injection.
In one method of treatment the chimeric ErbB ligand binding molecules can be immobilized to a solid support such as an apheresis or biocore support by standard methods. When the binding molecule is immobilized to a solid support the serum, blood or other biologically relevant fluid of a patient can be placed in contact with the solid support in the apheresis column to remove ErbB ligands from the fluid. The serum, blood or fluid can then be reintroduced into the patient.
The binding molecules can also be used in combination therapies. Thus, the chimeric ErbB ligand binding molecule may be administered in combination with one or more additional compounds or therapies, including chemotherapeutic agents, surgery, catheter devices, and radiation. Combination therapy includes administration of a single pharmaceutical dosage formulation which contains a chimeric ErbB ligand binding molecule and one or more additional agents. The chimeric ErbB ligand binding molecule and one or more additional agent(s) can be administered in their own separate pharmaceutical dosage formulations or together in the same formulation. For example, a chimeric ErbB ligand binding molecule and a cytotoxic agent, a chemotherapeutic agent or a growth inhibitory agent can be administered to the patient together in a single dosage composition or each agent can be administered in a separate dosage formulation. More specifically, the chimeric ErbB ligand binding molecule can be used in combination therapies that include therapeutic agents such as Lapatinib®, Herceptin®, Erbitux® and the like. Where separate dosage formulations are used, the chimeric ErbB ligand binding molecules and one or more additional agents can be administered concurrently, or at separately staggered times, i.e., sequentially. One of skill in the art can appreciate that the combination must be such that the chimeric ErbB ligand binding molecule does not interfere, but rather, accentuates the second therapeutic in the combination.
The invention also provides an article of manufacturing comprising packaging material and a pharmaceutical agent contained within the packaging material, wherein the pharmaceutical agent comprises at least one ErbB-binding fusion protein of the invention, and wherein the packaging material comprises a label or package insert which indicates that the ErbB-specific fusion protein can be used for treating an ErbB-mediated disease or condition.
Nucleotide sequences that encode the disclosed amino acid sequences are also contemplated. In addition, the conservative replacement of an amino acid with another similar amino acid that does not substantially (about 10-fold) interfere with ligand binding activity is specifically contemplated.
The DNA molecule was synthesized by starting with the desired amino acid sequence and optimizing the DNA sequence for mammalian system expression. The sequence was cloned into a suitable mammalian expression vector (pCpGfree-vitroHmcs) that can be selected using hygromycin and contains MAR/SAR sequences (insulator and boundary regions) and promoters and enhancers for trap expression. Vectors containing the sequence were transfected into CHO cells by standard transfection methods and the cells were selected for vector integration with hygromycin. Traps were purified from stably transfected cell lines by collecting cell culture medium and purifying by standard methods (protein A column binding). The chimeric protein was eluted from protein A by standard methods and quantitated using a custom derived ErbB 1 capture and IgG-Fc detection sandwich ELISA assay.
Claims
1. A chimeric ErbB ligand binding molecule and its pharmaceutically acceptable salt forms comprising SEQ ID NOS: 1, 2, or 3.
2. The chimeric ErbB ligand binding molecule of claim 1 and its pharmaceutically acceptable salt forms comprising SEQ ID NO: 3.
3. The chimeric ErbB ligand binding molecule of claim 1 and its pharmaceutically acceptable salt forms wherein the ErbB ligand binding molecule is fused to a portion of an IgGFc.
4. The chimeric ErbB ligand binding molecule of claim 1 and its pharmaceutically acceptable salt forms wherein the ErbB ligand binding molecule is fused to a portion of an IgGFc wherein the IgGFc is IgG1Fc.
5. A DNA sequence encoding a chimeric ErbB ligand binding molecule comprising SEQ ID NOS: 1, 2, or 3.
6. The DNA sequence of claim 4 further comprising an additional DNA sequence for expressing the chimeric ErbB ligand binding molecule in a host.
7. The DNA sequence of claim 4 wherein the DNA sequence is in a living host cell.
8. A pharmaceutical composition comprising a chimeric ErbB ligand binding molecule and its pharmaceutically acceptable salt forms comprising SEQ ID NOS: 1, 2, or 3 and a pharmaceutically acceptable excipient.
9. The pharmaceutical composition of claim 7 comprising a chimeric ErbB ligand binding molecule and its pharmaceutically acceptable salt forms comprising SEQ ID NO: 3 and a pharmaceutically acceptable excipient.
10. A method for treating a patient having a cancer that is sensitive to one or more ErbB ligands comprising administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising a chimeric ErbB ligand binding molecule and its pharmaceutically acceptable salt forms comprising SEQ ID NOS: 1, 2, or 3 and a pharmaceutically acceptable excipient.
11. The method for treating a patient having a cancer that is sensitive to one or more ErbB ligands of claim 9 comprising administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising a chimeric ErbB ligand binding molecule and its pharmaceutically acceptable salt forms comprising SEQ ID NO: 3 and a pharmaceutically acceptable excipient.
Translation - Spanish Moléculas de amplio espectro de unión a ligandos de ErbB y métodos para su uso.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los receptores tirosina quinasa están implicados en la estimulación del crecimiento de muchos tipos de cáncer. En general, los receptores tirosina quinasa son glicoproteínas formadas por: 1) un dominio extracelular con capacidad de unirse a un ligando específico; 2) una región transmembrana; 3) un dominio yuxtamembrana capaz de regular la actividad del receptor mediante fosforilación de la proteínas, por ejemplo; 4) un dominio tirosina quinasa que actúa como componente enzimático del receptor; y 5) un extremo carboxilo terminal. La familia de receptores tirosina quinasa de tipo I ErbB constituye una clase importante de dichos receptores por su importancia en la mediación del crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular en muchos tumores sólidos. Dentro de esta familia de receptores se encuentran el ErbB1 (también conocido como HER1), el ErbB2 (HER2/neu), el ErbB3 (HER3) y el ErbB4 (HER4). Más de una docena de ligandos interaccionan con la familia de receptores ErbB. Por ejemplo, tanto el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como el factor-α de crecimiento transformante (TGFα) y la anfirregulina (AREG) interaccionan fijándose al ErbB1. La heregulina y el factor de diferenciación neu (NDF), isoformas de la neuregulina, tienen afinidad específica por el ErbB3 y el ErbB4. Ligandos como la betacelulina, el factor de crecimiento epidérmico de unión a la heparina (HB-EGF) y la epiregulina se unen tanto al ErbB1 como al ErbB4.
Parece cada vez más claro que la sobreexpresión de los ligandos que activan al receptor ErbB puede dar lugar a un estado patológico por una proliferación celular incontrolada similar al que causaría una actividad desregulada del receptor. En dichos casos, la interferencia entre la unión del ligando activador a su receptor puede proporcionar una eficaz estrategia terapéutica o mejorar los resultados de los tratamientos dirigidos al receptor u otros tratamientos actuales. Las moléculas de unión capaces de atrapar y secuestrar el espectro completo de ligandos de ErbB podrían tener todavía una mayor aplicación en el tratamiento contra el cáncer.
Varios tratamientos terapéuticos se basan en esta estrategia de intentar atrapar o secuestrar el ligando. Por ejemplo, Enbrel™ (etanercept—Amgen) es una versión modificada soluble del receptor TNFR que se une secuestrando el ligando proinflamatorio TNFα. Asimismo, el uso de una proteína soluble que fusiona los receptores VEGFRI y VEGFR2, denominada EYLEA™, ha sido aprobado para el tratamiento de la degeneración macular y está investigándose en el tratamiento de varios tipos de cáncer (Regeneron Pharmaceuticals). Una molécula que se une secuestrando al receptor ErbB3 también ha demostrado potencial en experimentos in vitro, mejorando los efectos de un inhibidor de doble acción EGFR/ErbB2 y anulando la resistencia a GW2974 (una molécula de pequeño tamaño que inhibe a ErbbB1 y ErbB2) en células tratadas con NDF.
Todos los inhibidores de ErbB aprobados hasta el momento están dirigidos ya sea a EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 o a combinaciones de estas cuatro proteínas. Sin embargo, no se conoce ningún fármaco que interfiera en la unión de ligandos a múltiples receptores ErbB simultáneamente. De este modo, son necesarias nuevas moléculas de unión que se puedan usar para secuestrar ligandos de receptores, como los ligandos del receptor ErbB, y así bloquear la unión de este ligando a múltiples receptores ErbB y su subsecuente activación. Sería de especial utilidad el uso de moléculas de unión capaces de unirse a ligandos para otros receptores aparte del ErbB1 y el ErbB4, en particular a todos los ligandos de ErbB conocidos que estén acompañados de una respuesta inmune mínima.
Se han llevado a cabo varios estudios para determinar las regiones de ErbB3 importantes en la unión de su ligando, la heregulina (Singer et. al. (2001), J. Biol. Chem. 276, 44266-44274). En otros estudios en los que se han usado receptores quiméricos se ha identificado la aportación relativa de los dominios extracelulares de ErbB1 y ErbB4 en la señalización por ligando específico (Kim, et. al. (2002), Eur. J. Biochem. 269, 2323-2329). Estos estudios revelaron que la unión de la neuregulina a ErbB4 depende mucho más del dominio I que del dominio III y que el dominio III de ErbB1 es fundamental para la unión de EGF. Sin embargo, estos estudios se llevaron a cabo en receptores de cadena completa, incluidos los dominios transmembrana y citoplasmático. Estas moléculas de gran tamaño presentan problemas en cuanto a su manufacturación y administración, lo cual podría conllevar una disminución de su eficacia terapéutica.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
Se describe una molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB, junto con sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas. Esta molécula es una proteína que en su secuencia lleva incorporada las secuencias SEQ ID NOS: 1, 2 o 3. La molécula puede fusionarse con un IgGFc, especialmente si este IgGFc contiene mutaciones de cisteína a serina en la región bisagra. Por ejemplo, también se contempla la fusión con secuencias de ADN para IgG1Fc que codifican las moléculas ligando, así como vectores que contengan dichas secuencias de ADN y huéspedes que contengan dichos vectores. También se contemplan composiciones farmacéuticas que contengan la molécula ligando junto con un excipiente farmacéuticamente aprobado.
También se contemplan métodos para el tratamiento de pacientes con tipos de cáncer sensibles a uno o varios ligandos de ErbB. Estos métodos pueden implicar la administración de una dosis en una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto farmacéutico que contenga la molécula quimérica de unión a ligandos de Erbb.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 da a conocer una representación gráfica de la disminución de la expresión de p-EGFR al aumentar la concentración de LC010.
La FIG. 2 da a conocer una representación gráfica de la inhibición de p-EGFR en la que se incluye el cálculo de su IC50.
La FIG. 3 da a conocer un análisis gráfico de la disminución de la expresión de p-ErbB3 como respuesta al aumento en la concentración de LC010 en células McF7 tratadas con HRG1B.
La FIG. 4 da a conocer un análisis gráfico de la inhibición mostrada en la FIG. 3 en la que se incluye el cálculo del IC50.
La FIG. 5 da a conocer un análisis gráfico de la inhibición mostrada en la FIG. 4, además de la inhibición por Trap 6 en un experimento idéntico.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Para los propósitos de esta publicación el término "homología" hace referencia a cuando una región está formada por una secuencia de aminoácidos idéntica o cuando las substituciones en la secuencia de aminoácidos son conservativas, de la misma manera en que dicho término es normalmente utilizado en esta área.
Toda la numeración en la secuencia de aminoácidos en esta aplicación se refiere de manera exclusiva al péptido señal nativo.
Se ha desarrollado una molécula quimérica ErbB en la cual la secuencia de aminoácidos 1-249 de ErbB4, (SEQ ID NO. 1 a continuación), ha sido fusionada con la secuencia de aminoácidos 253-501 de ErbB1, (SEQ ID NO. 2 a continuación), como se muestra en SEQ ID NO. 3. Los puntos de unión descritos anteriormente para ErbB4 y ErbB1 han sido elegidos específicamente para reducir la inmunogenicidad de la proteína quimérica. La glutamina en la posición 126 de la secuencia de aminoácidos de ErbB4 puede ser sustituida por una asparagina para aumentar la afinidad de unión en ligandos específicos de ErbB1.
En ciertas realizaciones de la invención es posible fusionar la molécula quimérica ErbB a compuestos que produzcan la formación de agregados conjugados o que alarguen la vida media de la proteína. Por ejemplo, es posible fusionar la molécula quimérica ErbB a la región constante de una molécula de inmunoglobulina como la región Fc de una IgG. Para los propósitos de esta publicación la IgG2Fc y la IgG1Fc serían regiones Fc apropiadas. Asimismo, es posible el uso de otras utilizadas en esta área. En ciertos casos las regiones de la molécula pueden tener mutaciones que reduzcan la tendencia de Fc a dimerizar. Dentro de estos casos se pueden incluir, por ejemplo, substituciones de serina en lugar de cisteína en las posiciones 226 y 229 de la región IgG2Fc.
[TABLA-US-00001]
SEQ. ID. NO. 1
Q S V C A G T E N K L S S L S D L E Q Q Y R A L R K Y Y E N C E V V M G N L E I T S I
E H N R D L S F L R S V R E V T G Y V L V A L N Q F R Y L P L E N L R I I R G T K L Y
E D R Y A L A I F L N Y R K D G N F G L Q E L G L K N L T E I L N G G V Y V D N N K F
L C Y A D T I H W Q D I V R N P W P S N L T L V S T N G S S G C G R C H K S C T G R C
W G P T E N H C Q T L T R T V C A E Q C D G R C Y G P Y V S D C C H R E C A G G C S
G P K D T D C F A C M N F N D S G A C V T Q C P Q T F V Y N P T T F Q
SEQ. ID. NO. 2
M D V N P E G K Y S F G A T C V K K C P R N Y V V T D H G S C V R A C G A D S Y E
M E E D G V R K C K K C E G P C R K V C N G I G I G E F K D S L S I N A T N I K H F K
N C T S I S G D L H I L P V A F R G D S F T H T P P L D P Q E L D I L K T V K E I T G F L
L I Q A W P E N R T D L H A F E N L E I I R G R T K Q H G Q F S L A V V S L N I T S L G
L R S L K E I S D G D V I I S G N K N L C Y A N T I N W K K L F G T S G Q K T K I I S N
R G E N S C K A T G Q V C H A L C S P E G C W G P E P R D C V S
La secuencia de la molécula quimérica que incluye una secuencia señal (M E W S W V F L F F L S V T T G V H S) se expone a continuación:
[TABLA-US-00002]
SEQ ID NO. 3
M E W S W V F L F F L S V T T G V H S Q S V C A G T E N K L S S L S D L E Q Q Y R A
L R K Y Y E N C E V V M G N L E I T S I E H N R D L S F L R S V R E V T G Y V L V A L
N Q F R Y L P L E N L R I I R G T K L Y E D R Y A L A I F L N Y R K D G N F G L Q E L
G L K N L T E I L N G G V Y V D N N K F L C Y A D T I H W Q D I V R N P W P S N L T L
V S T N G S S G C G R C H K S C T G R C W G P T E N H C Q T L T R T V C A E Q C D G
R C Y G P Y V S D C C H R E C A G G C S G P K D T D C F A C M N F N D S G A C V T Q
C P Q T F V Y N P T T F Q M D V N P E G K Y S F G A T C V K K C P R N Y V V T D H G
S C V R A C G A D S Y E M E E D G V R K C K K C E G P C R K V C N G I G I G E F K D
S L S I N A T N I K H F K N C T S I S G D L H I L P V A F R G D S F T H T P P L D P Q E L
D I L K T V K E I T G F L L I Q A W P E N R T D L H A F E N L E I I R G R T K Q H G Q F
S L A V V S L N I T S L G L R S L K E I S D G D V I I S G N K N L C Y A N T I N W K K L
F G T S G Q K T K I I S N R G E N S C K A T G Q V C H A L C S P E G C W G P E P R D C
V S
Trap 6 es idéntico a LC010 con la excepción de una asparagina en la posición 126. Su secuencia SEQ ID NO. 4 se muestra a continuación:
[TABLA-US-00003]
SEQ ID NO. 4
Q S V C A G T E N K L S S L S D L E Q Q Y R A L R K Y Y E N C E V V M G N L E I T S I
E H N R D L S F L R S V R E V T G Y V L V A L N Q F R Y L P L E N L R I I R G T K L Y
E D R Y A L A I F L N Y R K D G N F G L Q E L G L K N L T E I L N G G V Y V D Q N K F
L C Y A D T I H W Q D I V R N P W P S N L T L V S T N G S S G C G R C H K S C T G R C
W G P T E N H C Q T L T R T V C A E Q C D G R C Y G P Y V S D C C H R E C A G G C S
G P K D T D C F A C M N F N D S G A C V T Q C P Q T F V Y N P T T Y Q M D V N P E G
K Y S F G A T C V K K C P R N Y V V T D H G S C V R A C G A D S Y E M E E D G V R K
C K K C E G P C R K V C N G I G I G E F K D S L S I N A T N I K H F K N C T S I S G D L
H I L P V A F R G D S F T H T P P L D P Q E L D I L K T V K E I T G F L L I Q A W P E N
R T D L H A F E N L E I I R G R T K Q H G Q F S L A V V S L N I T S L G L R S L K E I S
D G D V I I S G N K N L C Y A N T I N W K K L F G T S G Q K T K I I S N R G E N S C K
A T G Q V C H A L C S P E G C W G P E P R D C V S
Se fusionó la molécula quimérica de unión a ErbB de SEQ ID NO. 3 a una IgG2Fc con serina en lugar de cisteína en las posiciones 226 y 229 de la región Fc (LC010) y se aisló la proteína resultante. Se ha estudiado la capacidad de la molécula para inhibir el crecimiento de células A431 en presencia de TGFα añadido. Explicado de manera resumida, las células A431 fueron o bien tratadas con diferentes concentraciones de LC010 (de 62,5 a 500 nM) durante dos horas, o bien no recibieron tratamiento alguno. Tras las dos horas, las células fueron tratadas con 12,5 ng/mL de TGFα durante 10 minutos. Se recogieron las células lisadas y se les realizó un análisis para medir la activación de EGFR mediante un ensayo ELISA con p-EGFR. La gráfica de la FIG. 1 muestra cómo disminuye la expresión de p-EGFR al aumentar la concentración de LC010. En la FIG. 1.
Se ha realizado una gráfica del IC50 de la inhibición de LC010 sobre p-EGFR, como se muestra en la FIG. 2. Los resultados del cálculo del IC50 en dos experimentos han sido 0,6323 nM y 0,00173 nM.
Se fusionó la molécula quimérica de unión a ErbB de SEQ ID NO.: 3 a una IgG2Fc con serina en lugar de cisteína en las posiciones 226 y 229 de la región Fc (LC010) y se aisló la proteína resultante. Se ha estudiado la capacidad de la molécula para inhibir el crecimiento de células MCF7 en presencia de HRG1β añadido, como se muestra en la FIG. 3. Explicado de manera resumida, las células MCF7 fueron o bien tratadas con diferentes concentraciones de LC010 (de 62,5 a 500 nM) durante una hora, o bien no recibieron tratamiento alguno. Después de una hora, las células fueron tratadas con 12,5 ng/mL de HRG1β durante 10 minutos. Las células lisadas fueron recogidas y se les realizó un análisis de la activación de ErbB3 mediante un ensayo ELISA con p-ErbB3. La gráfica de la FIG. 3 muestra cómo disminuye la expresión de p-ErbB3 al aumentar la concentración de LC010. En ella se muestran los resultados de dos experimentos independientes.
Se ha realizado una gráfica del IC50 de la inhibición de LC010 sobre p-ErbB3, dicha gráfica se muestra en la FIG. 4. El IC50 de LC010 se encuentra dentro del rango nanomolar. Los resultados de los dos experimentos del cálculo del IC50 han sido 0,06725 nM y 0,1619 nM.
Se ha realizado una gráfica del IC50 de la inhibición de LC010 sobre p-ErbB3 comparándola al IC50 de la inhibición de Trap 6 (LC006) sobre p-ErbB3, dicha gráfica se muestra en la FIG. 5.
Existen varias razones por las que se pueden realizar substituciones en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, es posible modificar la secuencia de ADN de la molécula quimérica de unión para eliminar cisteínas de manera que se evite la formación de agregados mediante puentes disulfuro cisteína-cisteína. Las substituciones en la secuencia de aminoácidos en un subdominio pueden ser útiles para modificar la afinidad de unión de los ligandos. Por ejemplo, un aminoácido de ErbB1 puede ser substituido por uno del subdominio LI de ErbB4 para que la secuencia de este dominio sea más similar a la de ErbB 1 y, de esta manera, modificar la afinidad de la molécula a los ligandos de ErbB. De manera similar, es posible incluir substituciones de aminoácidos de los subdominios LII de ErbB4 en el subdominio ErbB 1. Es posible también realizar dichas substituciones en los subdominios SI y SII. Aunque es posible la substitución de cualquier número de aminoácidos, las substituciones de la glutamina de ErbB 1 por serina en la posición 13 de la secuencia ErbB4, tirosina por serina en la posición 42 y arginina por tirosina en la posición 123, son casos característicos. Cualquier persona con experiencia en el área puede encontrar más ejemplos simplemente comparando secuencias. También es posible la consideración de substituciones no homólogas. Por ejemplo, es posible la substitución de asparagina por serina en la posición 13 en lugar de la glutamina que se encuentra en ErbB 1, o también se podría usar un residuo con características intermedias entre los residuos de ambos receptores.
Además de al fragmento Fe de las IgG2, la proteína quimérica ErbB puede fusionarse con otras moléculas o fragmentos entre los que se incluyen: otros receptores quiméricos (de cualquier familia de receptores de factores del crecimiento) o secuencias que faciliten la purificación del producto. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas que van a fusionarse pueden obtenerse de fuentes comerciales e insertarse en cualquier vector apropiado para ser expresado en uno de los muchos huéspedes compatibles que se conocen.
También se contemplan las secuencias de ADN que codifican la molécula quimérica de unión a ligandos de Erbb. Una persona experta en el área puede apreciar que es posible el uso del código genético para preparar secuencias de ADN con este objetivo y que se puede igualmente incorporar a estas secuencias los codones sinónimos por los que tengan preferencia ciertos huéspedes específicos. Junto con estas secuencias de ADN, también se contempla el uso de secuencias adicionales de ADN que puedan ser usadas para la expresión de las secuencias de ADN. Se conoce una gran variedad de estas secuencias adicionales. Como es bien sabido dentro de esta área, estas secuencias adicionales pueden ser introducidas también en las células huéspedes para el mantenimiento o estabilización del ADN y para su expresión. También se encuentran contemplados estos huéspedes con estas secuencias de ADN incluidas.
También está contemplado el uso de composiciones farmacéuticas formadas por moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB. Dichas composiciones están formadas por una dosis efectiva de moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB y un excipiente farmacéuticamente aprobado. El término "farmacéuticamente aprobado" significa que ha sido aprobado por una agencia de regulación gubernamental incluida en el listado federal o estatal de los Estados Unidos de América, o reconocida por la United States Pharmacopeia o cualquier farmacopea oficial, generalmente reconocida para su uso en animales y, en particular, en humanos. El término "excipiente" hace referencia a un diluyente, adyuvante, vehículo o cualquier otro tipo de excipiente mediante el cual se administre el fármaco. Dichos excipientes farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluidos los derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, el aceite de sésamo y productos/líquido similares. Dentro de los excipientes farmacéuticos aptos se incluyen el almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, carbonato cálcico, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y aquellos en los que la molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB sea soluble y químicamente estable. La composición también puede contener agentes humidificantes o emulsionantes, o agentes tampón para el pH. Estas composiciones pueden presentarse en forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, pastillas, píldoras, cápsulas, (fórmulas) en polvo, fórmulas de liberación retardada y similares. Los excipientes farmacéuticamente aprobados incluyen otros ingredientes para su uso en fórmulas farmacéuticas como DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Se pueden utilizar surfactantes naturales o sintéticos. Es posible el uso de PEG (incluso de forma separada a su uso para derivatizar la proteína o análogo). Es posible el uso de dextranos, como el ciclodextrano. Es posible el uso de celulosa y sus derivados. Es posible el uso de aminoácidos, como en el caso de su uso en fórmulas tampón. Entre los diluyentes farmacéuticamente aprobados se incluyen: soluciones tampón de distinto contenido (por ejemplo, Tris-HCl, acetato o fosfato), reforzadores iónicos y de pH; aditivos como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascorbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, alcohol bencílico) y espesantes (por ejemplo, lactosa o manitol); la incorporación del material a ciertas preparaciones de compuestos poliméricos como el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico, etc. o a liposomas. Es posible el uso de ácido hialurónico, el cual puede prolongar la estancia del fármaco en el sistema circulatorio. Dichos compuestos pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de eliminación in vivo de las proteínas presentes y sus derivados. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) páginas 1435-1712, incorporadas aquí como fuentes de referencia. Las composiciones pueden ser preparadas en forma líquida o en polvo mediante liofilización. También se contemplan otras fórmulas como implantes de liberación retardada o formas farmacéuticas transdérmicas. También se contemplan excipientes como liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión, etc.
La cantidad de molécula quimérica activa que será efectiva para su uso terapéutico puede determinarse con técnicas clínicas estandarizadas. Además, pueden utilizarse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los rangos de dosis óptimos. En líneas generales, el régimen diario a seguir debería estar en el rango entre 0,1-1000 microgramos del agente activo (API) por kilogramo de peso, preferiblemente entre 0,1-150 microgramos por kilogramo. Es posible extrapolar las dosis efectivas a partir de las curvas de dosis-respuesta en ensayos in vitro o sistemas modelo de prueba en animales aptos. La dosis y el intervalo de la dosis pueden ajustarse individualmente para obtener niveles del compuesto en plasma suficientes para mantener el efecto terapéutico. En casos de administración local o toma selectiva, la concentración local efectiva del compuesto puede no estar relacionada con la concentración en plasma. El régimen de administración y dosis en el tratamiento puede ser determinado por el médico del paciente, teniendo en cuenta varios factores que pueden influir en la acción de los medicamentos. Por ejemplo, la edad, el estado de salud, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de la enfermedad, la hora de administración y otros factores clínicos.
La cantidad del compuesto administrado dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, de su peso, la gravedad de la afección/enfermedad, la forma de administración y el criterio del médico que lo prescriba. El tratamiento puede repetirse intermitentemente mientras se sigan detectando los síntomas, o incluso cuando estos no puedan detectarse. El tratamiento puede administrarse por sí solo o combinado con otros medicamentos.
Es posible formular la proteína de fusión de la invención en forma neutra o forma salina. Dentro de las sales farmacéuticamente aprobadas se incluyen aquellas con grupos amino libres, como las derivadas de los ácidos hidroclorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas con grupos carboxilo libres como los derivados del sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
Asimismo, las composiciones acuosas que son útiles para la práctica de los métodos de la invención son compatibles fisiológicamente en pH y osmolaridad. Se pueden incluir en el compuesto de la invención uno o varios agentes reguladores del pH aceptables o agentes tamponadores, incluidos: los ácidos como el ácetico, bórico, cítrico, láctico, fosfórico y ácidos hidroclorhídricos; las bases como el hidróxido de sodio, fostato sódico, borato de sodio, citrato de sodio, acetato sódico y lactato de sodio; y tampones como citrato/dextrosa, bicarbonato sódico y cloruro amónico. Dichos ácidos, bases y tampones se incluyen en la cantidad requerida, dentro de un rango aceptable, para mantener el pH de la composición. Es posible la inclusión de una o más sales aceptables en la composición en cantidades suficientes para llevar la osmolaridad del compuesto a un rango aceptable. Dichas sales incluyen aquellas con sodio, catión potásico o amónico y cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiosulfato o aniones bisulfito.
La cantidad de proteína de fusión que será efectiva para su uso terapéutico puede determinarse con técnicas clínicas estandarizadas basadas en la presente descripción. Además, pueden utilizarse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los rangos de dosis óptimos. En líneas generales, los rangos de las dosis apropiadas para la administración intravenosa oscilan entre 50-5000 microgramos de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los rangos de las dosis apropiadas para la administración intranasal oscilan en general entre 0,01 pg/kg de peso corporal y 1 mg/kg de peso corporal. Es posible extrapolar las dosis efectivas a partir de las curvas de dosis-respuesta en ensayos in vitro o sistemas de prueba en animales modelo.
La dosis y el intervalo de la dosis pueden ajustarse individualmente para obtener niveles del compuesto en plasma suficientes para mantener el efecto terapéutico. En casos de administración local o toma selectiva, la concentración local efectiva del compuesto puede no estar relacionada con la concentración en plasma. Una persona experta en el área será capaz de optimizar las dosis locales efectivas sin necesidad de excesiva experimentación.
La cantidad del compuesto administrado dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, de su peso, la gravedad de la afección/enfermedad, la forma de administración y el criterio del médico que lo prescriba. El tratamiento puede repetirse intermitentemente mientras se sigan detectando los síntomas, o incluso cuando estos no puedan detectarse. El tratamiento puede administrarse por sí solo o combinado con otros medicamentos.
Se describe un método para el tratamiento en pacientes en necesidad de tratamiento, el cual incluye la obtención de moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB, que se unen a ligandos de ErbB, interfiriendo con la interacción y el efecto de estos ligandos en el receptor ErbB de células cancerígenas, y la administración de una dosis efectiva de la molécula al paciente. La administración puede ser por vía parental, como la administración por vía intravenosa, por inyección directa en un tumor sólido, como a través de una jeringuilla o catéter o por inyección intraperitoneal.
En uno de los métodos de tratamiento las moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB pueden ser inmovilizadas mediante métodos estándar en un soporte sólido como una aféresis o biacore. Cuando se inmoviliza la molécula de unión en un soporte sólido, es posible poner el suero, la sangre o cualquier otro fluido biológicamente relevante, en contacto con el soporte sólido a través de una columna de aféresis para eliminar los ligandos de ErbB del fluido. El suero, la sangre o el fluido pueden ser reintroducidos posteriormente en el paciente.
Las moléculas de unión pueden usarse también en tratamientos combinados. Así pues las moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB pueden administrarse en combinación con uno o más compuestos o tratamientos, incluidos los agentes quimioterapéuticos, la cirugía, los catéteres y la radiación. Dentro de los tratamientos combinados se incluye la administración de una única forma farmacéutica que contiene moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB y a uno o varios agentes adicionales. Las moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB y uno o varios agentes adicionales pueden ser administrados por separado, en su propia forma farmacéutica, o juntos en una misma forma. Por ejemplo, una molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB y un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor de crecimiento pueden ser administrados al paciente de manera conjunta en una sola forma farmacéutica, o por separado en diferentes formas farmacéuticas. De manera más específica, las moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB pueden usarse en tratamientos combinados que incluyen agentes terapéuticos como Lapatinib®, Herceptin®, Erbitux® y similares. En los casos en los que se usen diferentes formas farmacéuticas, las moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB y uno o varios de los agentes adicionales pueden administrarse de manera conjunta o en tomas separadas en el tiempo, por ejemplo secuencialmente. Una persona experta en el área entenderá que dicha combinación debe darse de manera que las moléculas quiméricas de unión a ligandos de ErbB no interfieran, sino que acentúen los efectos del segundo tratamiento.
La invención también hace de público conocimiento un artículo acerca de la manufactura del material de empaquetado y un agente farmacéutico incluido en dicho material, en el cual dicho agente farmacéutico incluye al menos una proteína de fusión de unión a ErbB de la invención, y en el cual el material de empaquetado incluye una etiqueta o inserto de empaquetado que indica que la proteína de fusión específica para ErbB puede ser usada para tratar enfermedades mediadas por el receptor ErbB.
También se contemplan secuencias nucleotídicas que codifican las secuencias de aminoácidos descritas. Además, se contempla específicamente la substitución conservativa de un aminoácido por otro aminoácido similar que no interfiera substancialmente (aproximadamente una disminución de una décima parte) con la actividad de unión a ligandos.
La molécula de ADN ha sido sintetizada comenzando por la secuencia aminoacídica deseada y optimizando la secuencia de ADN para su expresión en sistemas de mamíferos. La secuencia ha sido clonada en un vector adecuado de expresión en mamíferos (pCpGfree-vitroHmcs) que puede ser seleccionado usando higromicina y que contiene secuencias MAR/SAR (regiones delimitadoras y terminales) y promotores y enhancers de la expresión de Trap. Los vectores con la secuencia incluida fueron transfectados a células CHO mediante métodos de transfección estándar y las células para la integración del vector fueron seleccionadas con higromicina. Los Traps fueron purificados a partir de líneas celulares estables de células transfectadas recogidas a partir de un medio de cultivo celular y purificadas mediante métodos estándar (columna de unión a proteína A). La proteína quimérica ha sido eluída a partir de proteína A mediante métodos estándar y cuantificada mediante captura con una ErbB 1 derivada y un ensayo sandwich ELISA de detección con IgG-Fc.
Reclamaciones
1. Una molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB y sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas que comprende las secuencias SEQ ID NO 1, 2 o 3.
2. La molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB de la reclamación 1 y sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas que comprenden la SEQ ID NO 3.
3. La molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB de la reclamación 1 y sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas en las cuales la molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB esta fusionada a una porción de una IgGFc.
4. La molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB de la reclamación 1 y sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas en las cuales la molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB esta fusionada a una porción de una IgGFc, en la que la IgGFc es una IgG1Fc.
5. Una secuencia de ADN que codifica una molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB que comprende las secuencias SEQ ID NO 1, 2 o 3.
6. La secuencia de ADN de la reclamación 4 que además comprende una secuencia de ADN adicional para la expresión de la molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB en el huésped.
7. La secuencia de ADN de la reclamación 4 en la que la secuencia de ADN se halla en una célula huésped viva.
8. Una composición farmacéutica que comprende una molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB y sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas comprendidas en las secuencias SEQ ID NO 1,2 o 3, y un excipiente farmacéuticamente aprobado.
9. La composición farmacéutica de la reclamación 7 que comprende una molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB y sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas comprendidas en la SEQ ID NOS: 3 y un excipiente farmacéuticamente aprobado.
10. Un método para tratar a pacientes con cáncer sensible a uno o varios ligandos de ErbB que comprende la administración de una dosis efectiva de una composición farmacéutica que comprende una molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB y sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas comprendidas en las secuencias SEQ ID NOS 1,2 o 3 y un excipiente farmacéuticamente aprobado.
11. El método para tratar a pacientes con cáncer sensible a uno o varios ligandos de ErbB de la reclamación 9 que comprende la administración de una dosis efectiva de una composición farmacéutica que comprende una molécula quimérica de unión a ligandos de ErbB y sus formas salinas farmacéuticamente aprobadas comprendidas en la SEQ ID NO 3 y un excipiente farmacéuticamente aprobado.
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Translation education
Master's degree - University College of London
Experience
Years of experience: 12. Registered at ProZ.com: Jun 2016.
English to Spanish (University College London, verified)
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