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Lucia Mancini

Italy
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English to Italian: Membrane-bound carbonic anhydrases in osteoclasts
Source text - English
Abstract

Osteoclasts are multinucleated bone-resorbing cells that use multiple pH regulation mechanisms to create an acidic pH in the resorption lacuna.
Carbonic anhydrase II and vacuolar H+-ATPases produce and transport protons, while chloride channels provide a Cl− flux into the resorption site.
These activities are required for inorganic matrix dissolution that precedes enzymatic removal of organic bone matrix. In other cell types it has
become evident that carbonic anhydrase isoenzymes interact with AE proteins to form transport metabolons that regulate intracellular pH.
Membrane-bound carbonic anhydrase isoenzymes may also compensate for the lack of cytoplasmic carbonic anhydrase II. Therefore, our goal was
to explore the expression of membrane-bound carbonic anhydrase (CA) isoenzymes CA IV, CA IX, CA XII and CA XIV in bone-resorbing
osteoclasts. Immunohistochemistry and confocal microscopy showed expression of CA IV, CA XII and CA XIV in cultured rat and human
osteoclasts. To confirm these results, RT-PCR was used. Immunohistochemistry revealed distinct staining patterns for CA IV, CA XII and CA XIV
in rat trabecular bone specimens. A plasma membrane staining was observed in bone lining cells with the CA XII antibody while osteoclast
plasma membranes were stained with CA IV and CA XIV antibodies. Confocal microscopy of cultured human osteoclasts showed a punctated
intracellular CA IV staining and a perinuclear CA XIV staining while no CA IX or CA XII staining was observed. To evaluate the physiological
role of membrane-bound CAs in osteoclasts, we used PCS, a novel membrane-impermeable CA inhibitor. Increased osteoclast number and bone
resorption activity was observed in rat osteoclast cultures exposed to a low concentration of PCS while higher concentrations affected cell
survival. PCS treatment also disturbed intracellular acidification in osteoclasts, as determined by live cell microscopy. In conclusion, our data
shows that membrane-bound carbonic anhydrase isoenzymes CA IV and CA XIV are expressed both at mRNA and protein levels in osteoclasts in
vivo and in vitro. In addition, the inhibitor experiments provide novel evidence to support the hypothesis that intracellular pH regulation in
osteoclasts may indeed involve transport metabolons.
Translation - Italian
Anidrasi carboniche di membrana negli osteoclasti.

Estratto

Gli osteoclasti sono cellule multinucleate deputate al riassorbimento osseo che usano meccanismi multipli di regolazione del pH per creare un pH acido nella lacuna di riassorbimento. L’anidrasi carbonica II e le H+-ATPasi vacuolari producono e trasportano protoni, mentre i canali del cloro forniscono un flusso di Cl- nel sito di riassorbimento. Queste attività sono necessarie per la distruzione della matrice inorganica che precede la rimozione enzimatica della matrice organica dell’osso. In altri tipi cellulari è stato comprovato che gli isoenzimi della anidrasi carbonica interagiscono con proteine a scambio ionico per formare catene enzimatiche di trasporto che regolano il pH intracellulare. Gli isoenzimi delle anidrasi carboniche di membrana possono inoltre compensare la mancanza di anidrasi carbonica citoplasmatica II. Lo scopo di questo studio era quindi esplorare l’espressione degli isoenzimi della anidrasi carbonica (CA) di membrana CA IV, CA IX, CA XII e CA XIV in osteoclasti in grado di riassorbire l’osso. L’analisi immunoistochimica e la microscopia confocale hanno dimostrato l’espressione di CA IV, CA XII e CA XIV in osteoclasti di ratto ed umani in coltura. Questi risultati sono stati confermati mediante RT-PCR. L’analisi immunoistochimica ha rivelato una distribuzione distintiva della colorazione per le CA IV, CA XII e CA XIV nei campioni di osso trabecolare di ratto. La colorazione della membrana plasmatica con l’anticorpo per la CA XII è stata osservata nelle bone lining cells (cellule bordanti ossee), mentre le membrane plasmatiche degli osteoclasti hanno reagito con gli anticorpi per la CA IV e CA XIV. L’analisi con microscopia confocale di osteoclasti umani in coltura ha mostrato una colorazione intracellulare puntiforme per la CA IV e una colorazione perinucleare per la CA XIV, mentre non si è osservata nessuna colorazione per la CA IX o CA XII. Per valutare il ruolo fisiologico delle CA di membrana negli osteoclasti, è stato impiegato PCS, un nuovo inibitore della CA impermeabile alla membrana. In osteoclasti di ratto in coltura esposti ad una dose bassa di PCS si è osservato un incremento nel numero degli osteoclasti e nell’attività di riassorbimento osseo, mentre l’esposizione a concentrazioni più elevate comprometteva la sopravvivenza cellulare. Il trattamento con PCS interferiva inoltre con l’acidificazione intracellulare negli osteoclasti come osservato mediante analisi microscopica di cellule viventi. In conclusione, i nostri dati dimostrano che gli isoenzimi delle anidrasi carboniche di membrana CA IV e CA XIV sono espressi negli osteoclasti in vivo e in vitro, sia a livello di RNA messaggero che a livello di proteina. Inoltre, gli esperimenti con l’inibitore forniscono una nuova prova a supporto dell’ipotesi che la regolazione del pH intracellulare negli osteoclasti possa invero coinvolgere catene enzimatiche di trasporto.

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